Elektroforesis
Elektroforesis
merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.
Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan,
bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk
separasi makromolekul (seperti protein
dan asam nukleat).
Posisi molekul
yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi,
ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk
makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi
karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis
biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul
biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan
yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis
antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan
agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein
dan asam nukleat.
Beberapa
faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni:
(Soedarmadji,
1996)
1. Ukuran
molekul protein
Migrasi molekul
protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi
molekul
berukuran kecil.
2. Konsentrasi
gel
Migrasi molekul
protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada
migrasi molekul
protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
3. Bufer
(penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan
dapat
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa
protein yang bermuatan.
●Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer
akan meningkatkan panas sehingga
aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini
dapat mempercepat gerakan
molekul protein.
●Kekuatan ion rendah dalam bufer akan
menurunkan panas sehingga aliran
listrik akan sangat minimal dan migrasi
molekul protein sangat lambat.
4. Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk
elektroforesis adalah bahan kimia inert yang
bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang
baik, sebagai migrasi elektron atau
penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji,
1996).
▬. Jika ukuran pori dari medium
kira-kira sama dengan molekul, maka molekul
yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih
besar akan dibatasi dalam migrasinya.
Besarnya pori-pori dapat diatur dengan
mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.
5. Kekuatan voltase
▬. Voltase yang dipakai rendah
(100-500) V, kecepatan migrasi molekul
sebanding dengan tingginya voltase
yang digunakan.
▬. Voltase yang dipakai tinggi
(500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan
untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu
harus searah (bukan bolak balik).
6. Temperatur medium disaat proses
elektroforesis berlangsung. Jika temperature tinggi akan mempercepat proses
bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi
kekuatan bermigrasinya protein. Pada saat elektroforesis berlangsung, protein
akan bergerak dari elektroda negative menuju elektroda positif sampai pada
jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin
rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau
mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan
bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah (Sumitro et al.,
1996).
Hasil
elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan
berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan
kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang
berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan
molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah
pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi
pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).
1. Ektraksi
enzim
Setelah sampel
dibersihkan ditempatkan didalam mortal dan diberi pengestrak sebanyak ± 200 (tergantung
dari banyaknya, sedikitnya sampel atau besar kecilnya sampel) kemudian smpel
digerus hingga halus. Penggerusan dilakukan pada kondisi dingin (± 4 0C) dan dilakukan
didalam meja pendingin. Agar suhu tetap konstan. Hasil gerusan tersebut
dimasukkan kedalam tabung eppendrof dan kemudian dilakukan sentrifuse dengan
kecepatan 2000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang didapat dipisahkan dari
endapan yang selanjutnya dimasukkan dalam tabung eppendof yang disimpan dalam
lemari pendingin (freezer) dalam suhu sekitar 70 0C.
2. Pembuatan gel
Cara pembuatan
gel adalah dengan melarutkan gel bubuk yang khusus digunakan untuk
elktroforesis pada erlenmeyer, kemudian di cetak pada cetakan khusus yang telah
disediakan dan ditunggu hingga kering. Dalam pembuatan agar, proporsi campuran
antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya
tidak akan dapat berjalan.
3. Penempatan
sampel
Gel dilepaskan
dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan menggunakan
pisau. Bagian ujung gel diiris atau dibuat sumuran dengan cetakan khusus kira 2
cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak
enzim. Ekstar enzim yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sebentar
hingga mencair. Pengambilan ekstrak enzim dilakukan dengan cara mencelupkan
kertas saring berukuran 6 x 15 mm ke ekstrak enzim atau dengan pipet mikro.
Potongan kertas saring yang telah berisi ekstrak enzim diletakkan dengan posisi
tegak lurus ke celah irisan gel. Jarak anatra celah 1-1.5 mm. Sebagai indicator
adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom
fenol.
4. Proses
Elektroforesis
Gel yang telah
siap kemudian diletakkan secara horizontal diatas kotak elektroforis yang telah
berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di dalam lemari
pendingin dengan suhu 40C. Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi
dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan antara larutan penyangga elektroda dengan gel. Setelah itu
gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin.
Proses elekrofororsis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel.
Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya
sebesar 50-70 A, 50-60 A atau 45-55 A selama kurang lebih 3 jam. Setelah
terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak ± 3 cm dari ujung
gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong,
sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara
horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis. Gel diiris menjadi
beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah
plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.
5. Visualisasi
sistem enzim
Visualisasi
sistem dilakukan dengan pewarna biokimia. Dengan komposisi yang telah
ditentukan sebelumnya. Atau dapat pula dilakukan dengan pancaran sinar Ultraviolet.
6. Metode
Analisis
Dalam hal ini
cara menganalisa hasil pita dari elektroforosis tersebut sangat tergantung dari
topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda
yang disebut pola pita (bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe pola pita
yang terbentuk. Semua tipe pola pita yang terbentuk diinterpretasikan sebagai lokus
isozim dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran parameter yang ada
dalam suatu populasi.
Jenis elektroforesis dibedakan
menjadi 2 yaitu :
1. Horizontal : Elektroforesis yang menggunakan agar rus,
gel party dengan konsentrasi 0.8%.
Semakin tinggi persentase agar rus, maka semkain kecil pori – pori yang
terbentuk, dan sebaliknya.
2. Vertical : menggunakan gel alimati,tapi kalau sudah jadi
akan menjadi gel poly aklimati elektroforesis.
Fitur pada elektroforesis
horizontal :
- Kekuatannya fragmen aklirik yang dipasang di kaki
karet non – slip
- Sebuah tutup pengaman satu satunya cara mencegah
akses untuk hidup komponen.
- Lugs membantu penghapusan tutup dan mencegah tekanan
pada terminal
- Sepenuhnya terselubung konektor pada tutupnya
- Berlapis emas terminal menahan korosi
Fitur pada elektroforesis Vertical
:
- Ideal untuk pemisahan resolusi tinggi
- Optional buffer volume tinggi atau rendah
- Leak buffer bebas segel
- Pendinginan mencegah distorsi
No comments