Isolasi DNA genom

Read Also

        Sampel DNA yang digunakan berasal dari sirip ekor ikan yang terlebih dahulu dibersihkan dengan larutan alkohol 95 % dan sirip dipotong kecil-kecil menggunakan gunting steril dalam petridish. Potongan sirip dimasukkan ke dalam tabung eppendor 1,5 ml yang telah diisi larutan CTAB 400 ml (yang sebelumnya telah dipanaskan dalam waterbath suhu 65 ⁰C dan diberi merkaptoetanol 100 ml, kemudian digerus dengan sumpit plastik sampai lembut. CTAB ini merupakan deterjen sintetis yang dapat memilah dan menyaring molekul DNA setelah terjadi lisis sel pada saat penggerusan (Suharsono, 2005).

      Materi sirip lembut hasil penggerusan diinkubasikan pada suhu 65 ⁰C selama 20 menit. Selanjutnya ditambahkan larutan Chloroform : Isoamylalcohol (24 : 1) sebanyak 500 ml dan divortex-mixer, kemudian disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke tabung eppendorf baru, serta ditambahkan larutan Phenol-Chlorofom-Isoamylalcohol (25 : 24 : 1) sebanyak 500 ml. Agar kedua larutan homogen, disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 15 menit sehingga terbentuk supernatan pada lapisan atas, dan lapisan tersebut dipindahkan ke tabung eppendorf baru.

     Tahap berikutnya dilakukan penambahan isopropanol dingin sebanyak 350 ml, dan diinkubasikan pada suhu -20 ⁰C selama 2 jam. Selesai inkubasi, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada putaran 13.000 rpm selama 15 menit, kemudian supernatan dibuang sehingga hanya tinggal pelet DNA yang mengendap di dasar tabung. Endapan pelet DNA ini diberi larutan etanol 70 % (dingin) sebanyak 600 ml, dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, endapan pelet DNA dikering udarakan selama 15 menit, dilanjutkan dengan penambahan larutan TE (Tris-EDTA) sebanyak 30 – 40 ml dan RNase sebanyak 10 % volume TE (3 – 4 ml). Hasil isolat ini kemudian disimpan dalam lemari es untuk pengerjaan elektroforesis.