Isolasi DNA Pada Buah

Read Also

Isolasi DNA adalah proses pemisahan DNA dari sel untuk mendapatkan DNA murni. Hasil akhir dari proses ini adalah strand-strand DNA dapat terpisah dari dalam sel dalam bentuk cincin seperti kabut putih yang terbentuk antara campuran ekstrak buah, detergen dan garam dengan alkohol. Sumber DNA yang digunakan pada praktikum kali ini adalah buah-buahan.

Langkah pertama untuk mengisolasi DNA adalah dengan memblender buah yang akan digunakan sebagai sumber DNA. Proses ini bertujuan untuk merusak dinding sel, membran sel, dan membran inti secara mekanik. Kemudian, hasil pemblenderan buah tersebut disaring lalu di tuangkan dalam larutan detergent yang telah diberi garam. Garam memiliki fungsi yang sama dengan SDS pada isolasi DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil. (Harley 2005: 410). Selain itu, garam berfungsi untuk menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya lysing buffer. Garam juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994 dalam Jamilah, 2005:21). Dari pernyataan tersebut, dapat disimpulkan bahwa selain digunakan untuk menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing  buffer, garam juga membantu proses pemekatan DNA.

Sedangkan detergent berfungsi untuk melisiskan barrier (penghalang) sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang  menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg2+ yang penting untuk mempertahankan keseluruhan struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler ynag dapat merusak DNA (ion Mg2+  merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang bisa “memakan” DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi lipid dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang sama dengan dodesil sulfat (Jamilah, 2005:11). Sedangkan menurut Machmud (2006), penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia.

Campuran tersebut diaduk perlahan agar tidak timbul buih. Pengadukan larutan bertujuan untuk untuk memperbesar pergerakan partikel sel dan detergen agar reaksi berlangsung cepat, karena detergent merupakan bahan yang dapat merusak membran sel. Tetapi jika pengadukannya terlalu cepat akan menimbulkan buih yang dapat menyebabkan terganggunya proses isolasi DNA. DNA akan sulit diamati karena terhalangnya penyatuan DNA di daerah atas antara alkohol dengan campuran ekstrak buah, detergent dan garam akibat adanya rongga udara yang ditimbukan oleh adanya buih.

Setelah itu, campuran dari ekstrak buah, detergent dan garam tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi, ditetesi dengan alkohol dingin hingga terlihat adanya cincin seperti kabut putih yang terbentuk di antara campuran dengan alkohol. Alkohol berfungsi untuk pengikatan strand DNA yang telah terkumpul karena pemekatan oleh garam. Jamilah (2005: 14) menyebutkan bahwa pemekatan dilakukan dengan penambahan ethanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi prespitasi DNA pada perbatasan kedua larutan. Seperti yang telah diketahui bahwa kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air, sehingga alkohol akan berada di bagian atas dari larutan dalam tabung reaksi. DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak seperti cincin kabut putih yang terbentuk di antara campuran dengan alkohol.

Alkohol yang ditambahkan harus dalam kondisi dingin. Jika dibandingkan dengan pernyataan Jamilah (2005: 14), dengan adanya garam (kation kovalen seperti Na⁺) dan pada suhu di bawah 20 ⁰C atau kurang, ethanol absolut akan mempresipitasikan asam nukleat polimerik dengan baik dan dalam Jamilah (2005: 21) juga disebutkan bahwa semakin dingin ethanol, DNA yang terpresipitasi semakin pekat. Dari pernyataan-pernyataan tersebut dapat diketahui bahwa semakin dingin alkohol, maka konsentrasi DNA yang akan terikat oleh alkohol tersebut akan semakin pekat atau tinggi sehingga DNA yang terisolasi dapat terlihat dengan jelas.