Penggunaan Nitrogen-Banteri Fiksasi untuk Memperbaiki Hasil Panen.

Read Also

Fokus penelitian sekarang--salah satunya yang memiliki pengaruh yang luas—adalah proses fiksasi nitrogen. Semua binatang dan tanaman dan sebagian besar bakteri tergantung dari ketersediaan beberapa bentuk nitrogen kombinasi pada lingkungannya: nitrat (NO₃^-), ammonia (NH₃), dan nitrogen-nitrogen sejenisnya-yang mengandung senyawa organik seperti asam amino. Jumlah besar N₂, yang tersedia di atmosper tidak mencukupi dunia biologi kecuali proses fiksasi nitrogen.

            Nitrogen telah difiksasi atau dirubah menjadi pupuk (sebagian besar garam amoniak), dengan proses industri sejak awal abad ini. Karena N₂ merupakan senyawa stabil yang luar biasa, perubahan N₂ menjadi NH₃ membutuhkan kondisi yang keras--temperatur lebih dari 500ºC dan tekanan melebihi 200 atm. Dengan demikian pembuatan pupuk kimia menghabiskan porsi energi yang sangat berarti. Disamping itu, jumlah besar pupuk yang digunakan pada lahan justru diserap oleh sungai, kolam, dan bahkan samudra, yang  kemudian menyebabkan polusi air yang cukup berarti, termasuk pertumbuhan alga yang tidak diinginkan dan mikroorganisme lain.

            Berbeda halnya, proses biologi fiksasi nitrogen, dilaksanakan oleh sejumlah kecil spesies prokariotik, tidak membutuhkan bahan bakar ataupun tenaga elektrik dan karena proses ini diatur sesuai dengan kebutuhan akan nitrogen dilingkungan yang diberikan, maka tidak menimbulkan polusi terhadap lingkungan. Dengan demikian, meningkatkan perluasan fiksasi nitrogen biologi merupakan tujuan penting dibidang bioteknologi. Menariknya, meskipun sejumlah besar pupuk kimia saat ini digunakan, diperkirakan banyak nitrogen atmosper yang difiksasi dengan organisme perbaikan nitrogen. Sesuai dengan salah satu perkiraan, proses biologi memfiksasi enam kali lebih nitrogen (24 x 107 ton/tahun) dari pada nitrogen yang diubah menjadi pupuk kimia melalui proses industri. Meskipun kemajuan kecil pada perluasan proses biologi akan memberikan dampak luas.

            Proses biologi fiksasi nitrogen sangat kompleks dan memerlukan banyak molekul ATP, karena enzim yang terlibat dalam proses ini harus mengatasi banyak rintangan energi aktivasi yang sama seperti sistesis kimia amonia. Dua enzim yang dibutuhkan adalah: Komponen I (nitrogenase) komponen II (nitrogenase reductase). Setelah komponen II dikurangi dengan reduktan biologi yang kuat (ferredoxin atau flavodoxin), 16 molekul (sudah dipercaya) ATP dihidrolisis untuk menyempurnakan reduksi komponen I. Hanya dengan komponen II yang sudah direduksi  saja tidak mampu mengatasi ringtangan energi aktivasi. Komponen I yang direduksi kemudian mereduksi N₂ menjadi dua molekul NH3 (Gb. 9.1). Fiksasi nitrogen adalh reaksi reduktif yang kuat, dan enzim yang terlibat selalu dinonaktifkan secara takterbalikkan ketika berinteraksi dengan oksigen. Kepekaan oksigen sangat penting untuk memengertikan biologi tentang N₂- fiksasi mikroorganisme seperti yang digambarkan dibawah ini.

            Kemampuan memfiksasi nitrogen ditemukan pada anggota terpencar kingdom eubakteri. Beberapa genus fiksasi nitrogen memiliki jarak yang cukup jauh dengan yang lainnya, yang menunjukan bahwa fungsinya mungkin ditransfer “secara menyamping”—yakni diantara organisme yang berbeda---selama evolusi. Beberapa kelompok fiksasi nitrogen adalah organisme bebas. Salah duanya adalah Clostridium dan Klebsiella fiksasi nitrogen yang berada pada kondisi anaerob, penyerapan yang konsisten dengan kepekaan oksigen enzim. Bakteri yang hidup bebas lainnya dapat memfiksasi nitrogen bahkan dalam kondisi aerob, karena masing-masing organisme ini mengembangkan perlindungan untuk melindungi alat fiksasi nitrogen dari oksigen. Dengan demikian kyanobacteri, yang melaksanakan fotosintesis, menunjukan fiksasi nitrogen hanya pada sel-sel khusus yang disebut heterosit, yang tidak menghasilkan oksigen. Azotobacter membutuhkan oksigen dalam jumlah yang besar, dan dalam pelaksanaanya bakteri ini melindungi alat fiksasi nitrogennya. Kelompok bakteri yang lain yang memfiksasi nitrogen hanya ketika bakteri tersebut memiliki hubungan simbion dengan tanaman. Hasil studi terbaik tentang pengikat nitrogen simbiotik adalah Rhizhobium, yang menyerang jaringan akar tanaman leguminous, seperti alfalfa, kacang polong, semanggi, dan kedelai serta tinggal didalam sel vakuola. Vakuola menjadi terisikan dengan ikatan oksigen-protein, leghemoglobin, yang dihasilkan tanaman. Kondisi ini menciptakan lingkungan yang rendah akan oksigen dimana Rhizobium dapat melaksanakan fiksasi nitrogen.

            Organisasi gen yang terlibat dalam fiksasi oksigen pertama kali diuraikan pada Klebsiella. Sungguh, pada genus tersebut sejumlah besar gen diorganisaikan menjadi kelompok tunggal gen nif (Gb. 9.2). penemuan ini mengantarkan, pada awal 1970an, pada suatu ide bahwa kloning terhadap kelompok gen tersebut kemudian meletakkan hasil klon pada tanaman panen yang diinginkan mungkin memproduksi persediaan tanaman tanpa pupuk kimia—sebuah kemungkinan yang jika disadari akan merevolusi pertanian. Tentu saja situasinya jauh lebih rumit.  Pertama, jika alat fiksasi nitrogen diproduksi dalam sel tanaman yang tidak tersedia mekanisme perlindungan yang dibutuhkan, proses fiksasi ini akan dinonaktifkan oleh oksigen. Kedua, sejumlah besar ATP yang dibutuhkan dalam proses ini juga harus tersedia. Pentingnya keberadaan ATP sangat jelas ketika kita membandingkan jumlah nitrogen yang difiksasi oleh simbion dan bakteri yang hidup bebas. Tanah yang ditutupi semanggi merah, membawa pasangan simbionnya, Rhizobium, memfiksasi kira-kira 300 kg N/hektar/tahun. Sebaliknya, bakteri yang hidup bebas seperti Azotobakter, pada tanah yang sama, hanya memfiksasi dalam jumlah yang kecil (sekitar 1 kg N/ hektar/tehun). Diantara organisme yang hidup bebas, kyanobakteri menyumbangkan lebih besar, tetapi jumlah N₂ yang difiksasi oleh bakteri tersebut dalam kondisi yang terbaik, jumlahnya lebih kecil dibanding aktivitas Rhizobium-kombinasi semanggi. Perbedaan ini diakibatkan oleh pemasukan energi yang besar.  Tanaman Leguminous tersusun dengan Rhizobiun dan menunjukan simbiosis yang sukses dengan mengekspresikan lebih dari 20 gen secara rinci untuk tujuan tersebut. Salah satu sumbangan dari tanaman inang ini adalah menyediakan aliran senyawa yang terus-menerus, seperti asam dikarboksilik, yang merupakan sumber energi bakteri. Fiksasi N₂ oleh organisme yang hidup bebas selalu dibatasi dengan persediaan energi yang terbatas (hal ini menjelaskan keberhasilan bakteri kyanobakteri, yang merupakan fototropik). Pemasukan sederhana gen nif tidak memberikan kemampuan pada tanaman untuk fiksasi Nitrogen.

            Kesadaran inilah yang membawa peneliti untuk mencoba lebih banyak pendekatan sederhana yang berhubungan dengan perbaikan N₂ simbiotik-fiksasi bakteri, seperti Rhizobium. Salah satu target yang mungkin untuk perbaikan adalah kadar fiksasi nitrogennya. Pada spesies Rhizobium, semua gen yang terlibat dalam proses fiksasi nitrogen, dan juga sebagian besar gen yang terlibat interaksi dengan tanaman diketahui berada dalam plasmid (“Plasmid Sym”). Ukurannya berkisar 200-300 kb dalam R. leguminosarum sampai 1200-1500 kb dalam R. meliloti. Penggabungan ekspresi protein regulator pada gen tesebut, atau peningkatan sederhana jumlah duplikat gen ditemukan untuk memproduksi peningkatan kecil namun berarti pada jumlah nitrogen yang difiksasi pada tanaman inang yang sesuai.

            Area lain yang memiliki potensi untuk perbaikan adalah interaksi antara inang-bakteri. Meskipun interaksi antara Rhizobium dengan inangnya sangat komplek, banyak gen yang sesuai diidenfikasi. Rhizobium tidak hanya mengenali tanaman yang diujikan sebagai inang tetapi juga menginduksi semua kumpulan reaksi didalamnya, yang menyebabkan akar-akar serabut mengeriting, benang infeksi terbentuk, benang tersebut kemudian berkembang menjadi membrane yang menyelubungi bakteri. Bakteri ini juga menginduksi tanaman untuk mengeluarkan leghemoglobin, memenuhi tempat disekitaran bakteri dan menyalurkan dengan konstan sejumlah besar sumber energi bagi bakteri (seperti asam dikarboksilik), seperti yang dijelaskan sebelumnya. Seperti contohnya, produk gen Rhizobium nodD menanggapi senyawa flavonoid khusus yang diproduksi oleh  tanaman dan mengaktifkan gen lain yang terlibat dalam nodulasi. Dengan menggabungkan susunan nodD, akan memungkinkan untuk mengubah (dan kadang memperluas) spesifikasi inang dari strain Rhizobium yang diujikan. Pada proses nodulasi berikutnya, produk gen nodH dan nodQ Rhizobium mensintesis berat molekulaar rendah (low-molecular-weight) menandai molekul yang dikenali oleh tanaman inang khusus, yang menanggapi keritingnya akar rambut dan sebagainya. Mengganti gen dari spesies Rhizobium yang berbeda pada gen-gen tersebut menghasilkan penggabungan yang sukses pada susunan inang.

            Hasil ini sangat mengagumkan, tetapi belum ada yang mampu memproduksi strain “perbaikan” yang menunjukan secara efektif dibawah kondisi penelitian. Salah satu masalah utama adalah bahwa strain yang dimasukkan dari sumber eksternal tidak selalu mampu bersaing pada tanah alami. Lahan dimana tanaman leguminous ditumbuhkan pada basis regular, tanah yang digunakan cenderung mengandung banyak strain Rhizobium yang khusunya cocok bertahan pada lingkungan yang berbeda, meskipun efesiensi fiksasi N₂nya bisa tidak bersaing dengan strain rancangan terbaru. Studi menunjukan ketika strain Rhizobium yang seharusnya memfiksasi N₂ yang lebih efisien dimasukkan pada lahan tersebut, strain ini sangat jarang mampu bertahan akan tekanan reaksi dari strain asli. Tujuan lain dari pemasukan strain Rhizobium yang diatur secara genetik supaya menempel pada hasil produksi kolonisasi yang lebih baik dan kelompok yang lebih yang mampu bertahan—namun sayangnya, kondisi ini merupakan bidang yang sedikit diketahui oleh peneliti.

            Usaha untuk memperluas jagkauan inang Rhizobium yakni untuk menyertakan tanaman nonleguminous, telah disebutkan sebelumnya. Namun, sedikit dari sifat kompleks interaksi Rhizobium—tanaman inang akan tidak mudah. Banyak penelitian dilakukan pada asosiatif dengan alay fiksasi N₂, yang hubungan simbiotiknya dengan tanaman jauh. Spesies Azospirillum misalnya, tumbuh berasosiasi dengan tanaman bahan pangan monokotil seperti tanaman tebu, ikatan dengan inangnya hanya berupa lembaran, dan sebagian besar mengkoloni pada permukaan akar. Ada harga yang harus dibayar untuk hilangnya ciri interaksi. Tanaman tidak dapat memnyediakan nutrisi secara berkesinambungan ke bakteri dibawah kondisi seperti itu, efisiensi fiksasi N₂ dalam sistem seperti tersebut tidak dapat terbentuk dalam jumlah yang tinggi