Adsorpsi Antigen ke Adjuvant Aluminium

Read Also

Ajuvan aluminium terdiri dari partikel primer skala nano (Gambar). Nanopartikel AH berbentuk memanjang, berukuran sekitar 4 × 2 × 10 nm, sedangkan nanopartikel AP berbentuk seperti pelat dengan diameter sekitar 50 nm. Nanopartikel ini membentuk agregat berpori yang terhubung secara longgar yang bervariasi dalam ukuran dari 1 hingga sekitar 20 µm tergantung pada bahan adjuvant, metode yang digunakan untuk pengukuran ukuran partikel, dan kondisi percobaan. Paparan gaya geser dan ultrasonikasi menurunkan ukuran partikel bahan adjuvant agregat, sedangkan suspensi bahan adjuvant dalam garam meningkatkan agregasi dan ukuran agregat. Kemampuan agregat untuk berdisosiasi dan berkumpul kembali pada pencampuran berkontribusi pada pemerataan antigen yang teradsorpsi dalam formulasi vaksin. Nanopartikel primer yang membentuk agregat memberikan kontribusi yang sangat besar permukaan, diperkirakan 514 m2/g untuk AH (Rehydragel HPA), bila diukur dengan adsorpsi air menggunakan spektroskopi inframerah gravimetri. Luas permukaan yang jauh lebih kecil dilaporkan untuk Alhydrogel (350 m2/g) dan Rehydragel LV (300 m2/g), tetapi ini ditentukan oleh adsorpsi nitrogen yang secara signifikan meremehkan luas permukaan sebagai akibat dari dehidrasi sampel dan runtuhnya agregat. Selama penyimpanan di suhu kamar, bahan adjuvant aluminium menjadi lebih teratur karena deprotonasi dan dehidrasi. Proses "penuaan" ini mengurangi luas permukaan dan menghasilkan sedikit pengurangan kapasitas penyerapan selama periode 15 bulan.

Adsorpsi antigen ke bahan adjuvant aluminium dapat berkontribusi langsung pada efek peningkatan kekebalan dari bahan adjuvant aluminium seperti yang dibahas di bawah ini. Selain itu, adsorpsi ke adjuvant dapat mencegah adsorpsi antigen ke dinding vial atau spuit, sehingga memastikan injeksi antigen dosis penuh. Adsorpsi antigen ke adjuvant terjadi melalui mekanisme hidrofobik, elektrostatik, dan pertukaran ligan, antara lain. Antigen yang dimurnikan atau disintesis secara kimia adalah struktur kompleks besar yang terdiri dari protein yang terdiri dari beragam 20 asam amino, kadang-kadang terkonjugasi dengan rantai oligo- atau polisakarida dan lipid. Keragaman ini membuat sulit untuk memprediksi perilaku adsorpsi antigen pada bahan adjuvant aluminium, seperti juga kasus interaksi protein dengan permukaan padat lainnya. Protein cenderung teradsorpsi ke permukaan padat dan umumnya adsorpsi tertinggi ketika pH mendekati iep protein. Meskipun sebagian besar residu hidrofobik terkubur di dalam protein globular, protein memiliki residu hidrofobik di permukaan yang dapat berinteraksi dengan antarmuka padat. Ukuran dan distribusi tambalan hidrofobik ini menentukan kekuatan interaksi hidrofobik. Selain itu, adsorpsi antigen protein dapat mengakibatkan pembukaan sebagian, menghasilkan paparan residu hidrofobik tambahan, yang selanjutnya berinteraksi dengan permukaan adjuvant. Ini dapat berkontribusi pada peningkatan kekuatan adsorpsi pada penuaan campuran antigen-adjuvant tertentu

Interaksi elektrostatik terjadi ketika antigen dan adjuvant memiliki muatan yang berlawanan dan merupakan mekanisme utama untuk adsorpsi antigen ke adjuvant aluminium. Pada pH netral, AH memiliki muatan permukaan positif dan AP memiliki muatan permukaan negatif. IEP antigen protein dapat digunakan sebagai titik awal untuk menentukan apakah kemungkinan akan mengalami adsorpsi elektrostatik ke AH atau AP.  Namun, penting untuk mengenali bahwa IEP mewakili jaringan semua gugus bermuatan protein dan bahwa distribusi muatan akan mempengaruhi interaksi dengan partikel ajuvan. Kasus ekstrim dari literatur terdiri dari protein fusi yang terdiri dari dua peptida, satu dengan iep 10 dan peptida kedua dengan iep 5,5. Meskipun iep rata-rata adalah 9,3, ia teradsorpsi dengan baik untuk AP dan AH mungkin dengan orientasi yang berbeda.

Interaksi terkuat antara adjuvant aluminium dan antigen didorong oleh mekanisme pertukaran ligan. Seperti disebutkan di atas, aluminium memiliki afinitas tinggi untuk fosfat, dan fosfat dapat bertukar gugus hidroksil pada permukaan bahan adjuvant aluminium. Kehadiran dan paparan gugus fosfat terminal dalam beberapa antigen memungkinkan pengikatan melalui pertukaran ligan. Pengikatan antigen tersebut ke bahan adjuvant aluminium melalui pertukaran ligan bahkan dapat mengatasi tolakan elektrostatik. Pertukaran ligan terjadi dengan kedua jenis ajuvan aluminium, tetapi lebih kuat di AH karena ajuvan ini memiliki lebih banyak hidroksil permukaan yang tersedia daripada AP. Pertukaran ligan mungkin terlibat dalam pengikatan partikel mirip virus hepatitis B surface antigen (HBsAg), kemungkinan melalui pembentukan gugus fosfat terminal dengan hidrolisis fosfolipid terbatas. Terminal fosfat (PO4) atau fosfonat (CH2-PO3) gugus juga dapat ditambahkan ke antigen protein melalui konjugasi dengan fosfoserin atau dengan penghubung yang dirancang khusus dengan satu atau lebih gugus fosfonat terminal. Konjugasi lisozim dengan dua penghubung fosfonat memungkinkan pengikatan lisozim ke AH terlepas dari kenyataan bahwa kedua senyawa tersebut membawa muatan positif. Ketersediaan gugus hidroksil permukaan untuk pertukaran ligan dapat ditentukan dengan mengukur fosfofilisitas permukaan. Uji ini menggunakan senyawa kromogenik atau fluorogenik dengan gugus fosfat terminal. Adsorpsi melalui pertukaran ligan menghasilkan hidrolisis dan pelepasan produk berwarna atau fluoresen.

Tingkat adsorpsi antigen biasanya dihitung dengan menentukan jumlah protein dalam supernatan setelah sentrifugasi campuran antigen-bahan adjuvant, setelah inkubasi jangka pendek. Jumlah protein dalam supernatan hanya dikurangi dari jumlah yang awalnya ditambahkan, untuk menentukan jumlah teradsorpsi. Dengan menambahkan jumlah antigen yang berbeda sambil menjaga konsentrasi bahan adjuvant konstan, kapasitas adsorpsi bahan adjuvant untuk antigen tertentu dapat ditentukan dengan membangun isoterm adsorpsi. Proses ini agak melelahkan, tetapi dapat dengan mudah diotomatisasi menggunakan sistem penanganan cairan dengan throughput tinggi. Adsorpsi antigen protein ke bahan adjuvant aluminium biasanya dianalisis menurut model adsorpsi Langmuir, yang memungkinkan penghitungan beberapa parameter adsorpsi termasuk koefisien adsorpsi, korelasi kekuatan interaksi antigen-ajuvan. Namun, meskipun isoterm adsorpsi dapat menyerupai model Langmuir, adsorpsi protein ke permukaan padat tidak memenuhi premis di mana model Langmuir digunakan. based. Pendekatan alternatif untuk menentukan kekuatan adsorpsi adalah untuk menilai tingkat desorpsi pada paparan serum atau cairan getah bening, atau untuk melakukan studi dalam buffer kekuatan ionik yang lebih tinggi untuk bersaing dengan antigen. Namun, evaluasi dengan adanya serum atau getah bening memerlukan tes antigen spesifik untuk menentukan konsentrasi antigen dalam cairan kompleks ini. Desorpsi dapat dihasilkan dari paparan anion yang mengalami pertukaran ligan dengan hidroksil permukaan pada permukaan adjuvant, atau perpindahan kompetitif oleh protein lain seperti fibrinogen. Sebuah uji desorpsi kuantitatif dikembangkan untuk HBsAg berdasarkan afinitas tinggi aluminium untuk fluor. Anion fluorida memiliki afinitas yang lebih tinggi terhadap aluminium daripada fosfat dan dapat mendesorbsi antigen terfosforilasi seperti HBsAg. Derajat desorpsi berbanding terbalik dengan kekuatan adsorpsi. Metode alternatif adalah untuk menentukan pengaruh adsorpsi antigen pada adsorpsi dan hidrolisis senyawa fluorogenik. Penurunan hidrolisis (disebut fosfofilisitas permukaan relatif) berkorelasi terbalik dengan afinitas antigen. Kekuatan adsorpsi merupakan parameter penting karena adsorpsi yang terlalu ketat dapat mengganggu respons antibodi, seperti yang diilustrasikan oleh model antigen alfa-kasein, yang memiliki delapan gugus fosfat yang tersedia untuk pertukaran ligan, menghasilkan adsorpsi yang kuat pada AH. Kasein yang teradsorpsi kuat tidak menginduksi aktivasi sel-T mungkin karena adsorpsi mengganggu pemrosesan antigen. Pengurangan kekuatan adsorptif dengan pretreatment AH dengan buffer fosfat memungkinkan aktivasi sel T dan menghasilkan respon antibodi yang lebih kuat. Demikian pula, respon antibodi terhadap HBsAg ditingkatkan dengan pretreatment AH dengan buffer fosfat dibandingkan dengan AH saja. kekuatan juga dapat mempengaruhi tingkat perubahan struktural berikut adsorpsi dan, karenanya, integritas epitop konformasi. Pengaruh kekuatan adsorpsi pada luas dan besarnya respon imun adalah area yang memerlukan penyelidikan lebih lanjut, terutama dengan antigen baru.

Jumlah protein yang diadsorpsi ke bahan adjuvant aluminium juga dapat ditentukan secara langsung. Uji o-phthalaldehyde (OPA) mengukur sinyal fluoresen yang dibuat ketika OPA bereaksi dengan gugus amina terminal dan telah digunakan untuk menentukan jumlah protein yang teradsorpsi pada AH. Keterbatasan pengujian termasuk sensitivitasnya, karena hanya dapat digunakan untuk konsentrasi protein lebih besar dari 25 µg/ml, dan tidak cocok untuk beberapa formulasi, karena gangguan dari eksipien yang mengandung gugus amina (seperti buffer Tris). Sebuah metode alternatif adalah untuk mengukur kandungan nitrogen total dengan chemiluminescence, meskipun teknik ini juga tunduk pada interferensi dari eksipien yang mengandung gugus amina. Selain itu, adsorpsi spesifik antigen dapat ditentukan dengan panel antibodi monoklonal baik dengan fluoresensi berbasis pelat atau flow cytometry. Tes ini memerlukan antibodi spesifik antigen yang dikarakterisasi dengan baik, tetapi memiliki keuntungan bahwa adsorpsi antigen spesifik dapat ditentukan dalam vaksin kombinasi yang mengandung banyak antigen. Selain itu, penelitian tersebut dapat memberikan informasi tentang stabilitas struktural dari antigen yang teradsorpsi. Seseorang harus berhati-hati untuk menghindari atau mengontrol adsorpsi langsung antibodi terhadap bahan adjuvant aluminium dalam pengembangan pengujian tersebut. Kami juga telah menjelaskan pendekatan berbasis Luminex® di mana tingkat adsorpsi beberapa antigen dapat dievaluasi secara bersamaan dalam vaksin kombinasi kompleks. Penggunaan antibodi untuk mengevaluasi integritas antigenik dalam vaksin teradsorpsi juga menawarkan peluang untuk mengembangkan potensi in vitro tes.

Selain karakterisasi antigen yang teradsorpsi pada garam aluminium, penting juga untuk memahami efek antigen dan komponen vaksin lainnya pada sifat fisikokimia garam aluminium itu sendiri. Perubahan tersebut dapat berdampak pada reproduktifitas eksperimen dan kinerja produk, jika tidak dipahami dan dikontrol dengan baik. Berbagai teknik karakterisasi berguna untuk menjelaskan sifat fisikokimia garam aluminium. Karena sifat garam aluminium yang heterogen, analisis ukuran partikel paling baik dilakukan dengan menggunakan kombinasi teknik pelengkap daripada mengandalkan teknik tunggal. Misalnya, banyak agregat partikel dalam AH dan AP mungkin berukuran terlalu besar untuk dinilai secara akurat dengan hamburan cahaya dinamis. Dalam hal ini, ukuran partikel difraksi laser dan mikroskop optik dan/atau elektron mungkin berguna. Teknik karakterisasi lain yang relevan termasuk difraksi sinar-X untuk menilai struktur kristal formulasi aluminium, mikroelektroforesis untuk memantau perubahan potensial zeta, dan profil laser scattering optical untuk mengukur laju sedimentasi.

Lebih lanjut, penting untuk dicatat bahwa pemrosesan garam aluminium (misalnya untuk pengisian/penyelesaian produk vaksin) juga dapat menimbulkan tantangan. Misalnya, karena laju sedimentasi yang relatif cepat, perhatian harus diberikan untuk memastikan bahwa proses pengisian/penyelesaian dapat secara akurat mengontrol jumlah bahan adjuvant aluminium di setiap botol. Kandungan ion aluminium dapat dinilai dengan analisis unsur (misalnya spektroskopi emisi atom plasma yang digabungkan secara induktif).