DNA
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA
terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya
adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein
histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak
berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas
memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis
ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan
sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot
berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein
histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan
memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315--316; Raven &
Johnson 2002: 94).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. 'Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176--178).
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome Project 2005: 1).png)
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan, yaitu darah.
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel darah merah. Setelah dilakukan inkubasi, darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel darah putih.
Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat (Kimball 2005: 4; Lewiston 2002:1--3; LPCH 2005: 2).
Tahap isolasi jaringan; untuk mengisolasi jaringan sel darah putih, maka darah yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung yang berisi darah diberikan larutan pelisis sel darah merah yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel darah merah terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balik denan gerakan memutar yang membentuk angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10 menit. Darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang. Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel darah putih yang terisolasi tadi, diberikan larutan pelisis sel darah putih yang terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur (Rybicki & Purves 2005: 1; Harley 2005: 410).
Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya; Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Tahap berikutnya yaitu presipitasi; Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik kembali dengan gerakan angka 8. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi (Harley 2005: 409--410; Lewiston 2002: 1--2).
Isolasi DNA genom buah pisang memiliki prinsip yang sama dengan isolasi DNA sel darah putih. Langkah pertama adalah dengan memasukkan buah pisang ke dalam blender dan blender selama 5 menit. Hasil blender kemudian ditambahkan air dengan perbandingan 1:1 dan garam lalu diaduk selama 15 menit. Garam memiliki fungsi yang sama dengan SDS pada isolasi DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil. Campuran tersebut kemudian disaring dengan corong dan ditambahkan isopropanol yang berfungsi untuk memvisualisasikan DNA dan menetralkan (desalted) sebab isopropanol tidak memiliki muatan, sedangkan DNA bermuatan negatif (-). Kemudian tabung dibolak-balik untuk mendapatkan DNA. Akan tetapi, setelah diberikan Tris-EDTA, yang didapat oleh praktikan hanyalah pengotor yang tidak larut di dalamnya. Hal ini dapat terjadi karena kurang teliti dalam mengerjakan proses isolasi tersebut (Harley 2005: 410).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. 'Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176--178).
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome Project 2005: 1)
.png)
- DNA
juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun pada tumbuhan. DNA manusia
dapat diisolasi melalui darah. Darah manusia terdiri atas plasma darah,
globulus lemak, substansi kimia (karbohidrat, protein dan hormon), dan gas
(oksigen, nitrogen dan karbon dioksida). Plasma darah terdiri atas
eritrosit (sel darah merah), leukosit (sel darah putih) dan trombosit
(platelet). Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih. Sel darah
putih dijadikan pilihan karena memiliki nukleus, di mana terdapat DNA di
dalamnya. DNA pada tumbuhan juga dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan
bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang (Musa sp.)
(Kimball 2005: 8; Kent & Carr 2001: 317).
- Isolasi
DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu:
- 1. Isolasi jaringan
- 2. Dinding dan membran sel dilisiskan
- 3. Diekstraksi dalam larutan
- 4. Dipurifikasi
- 5. Dipresipitasi
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi.
Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan, yaitu darah.
Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel darah merah. Setelah dilakukan inkubasi, darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak nukleus sel darah putih.
Tahap berikutnya adalah purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya, dan tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat (Kimball 2005: 4; Lewiston 2002:1--3; LPCH 2005: 2).
Tahap isolasi jaringan; untuk mengisolasi jaringan sel darah putih, maka darah yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung yang berisi darah diberikan larutan pelisis sel darah merah yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel darah merah terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selanjutnya tabung dibolak-balik denan gerakan memutar yang membentuk angka 8 agar larutan dapat menyatu dengan sempurna selama 10 menit. Darah yang telah bercampur dengan pelisis sel darah merah tersebut lalu disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 2500 rpm. Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang. Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel darah putih yang terisolasi tadi, diberikan larutan pelisis sel darah putih yang terdiri atas EDTA dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur (Rybicki & Purves 2005: 1; Harley 2005: 410).
Tahap selanjutnya yaitu purifikasi. Purifikasi bertujuan untuk membersihkan sel darah putih dari zat-zat lainnya; Ke dalam larutan tadi kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur. Tahap berikutnya yaitu presipitasi; Tahap presipitasi dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Supernatan yang berisi DNA kemudian dituangkan ke dalam tabung berisi isopropanol dingin dan tabung dibolak-balik kembali dengan gerakan angka 8. Pemberian isopropanol bertujuan untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil dari sentrifugasi adalah terdapatnya pelet DNA pada dasar tabung yang kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. Setelah tercampur, tabung kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm. Hasil akhirnya adalah DNA yang berada pada tepi dasar tabung. Langkah akhirnya adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi (Harley 2005: 409--410; Lewiston 2002: 1--2).
Isolasi DNA genom buah pisang memiliki prinsip yang sama dengan isolasi DNA sel darah putih. Langkah pertama adalah dengan memasukkan buah pisang ke dalam blender dan blender selama 5 menit. Hasil blender kemudian ditambahkan air dengan perbandingan 1:1 dan garam lalu diaduk selama 15 menit. Garam memiliki fungsi yang sama dengan SDS pada isolasi DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi berjalan lebih stabil. Campuran tersebut kemudian disaring dengan corong dan ditambahkan isopropanol yang berfungsi untuk memvisualisasikan DNA dan menetralkan (desalted) sebab isopropanol tidak memiliki muatan, sedangkan DNA bermuatan negatif (-). Kemudian tabung dibolak-balik untuk mendapatkan DNA. Akan tetapi, setelah diberikan Tris-EDTA, yang didapat oleh praktikan hanyalah pengotor yang tidak larut di dalamnya. Hal ini dapat terjadi karena kurang teliti dalam mengerjakan proses isolasi tersebut (Harley 2005: 410).
No comments