shRNA (Short-hairpin RNA) Struktur, Definisi, Mekanisme

Read Also

Apa itu shRNA (Short-hairpin RNA)?

shRNA adalah Short-hairpin RNA, yang lebih pendek, diproduksi secara artifisial double-stranded ribonucleic acid yang dapat digunakan dalam penyelidikan silencing gen.

• shRNA adalah bentuk teknologi RNA interference (RNAi) yang digunakan untuk menyelidiki fungsi gen yang tidak dikarakterisasi.

• RNAi berfungsi dengan menghambat fungsi gen untuk memeriksa proses yang terpengaruh. Ini digunakan untuk mengkarakterisasi jalur biologis dengan mengidentifikasi interaksi antara gen, gen, dan protein.

• Ini juga berkontribusi pada kemajuan pengetahuan kita tentang jalur molekuler yang mendasari keadaan penyakit.

• Secara eksperimental, RNA interference (RNAi) dapat diinduksi dengan dupleks small interfering RNA (siRNA) atau dengan shRNA yang diekspresikan dari vektor plasmid atau DNA genom setelah integrasi yang dimediasi lentiviral.

• shRNA dapat diberikan ke sel dengan transfeksi lipid dari vektor plasmid atau transduksi virus.

• Urutan shRNA dikodekan dalam urutan yang dikirim, dan ekspresi inti shRNA didorong oleh promotor RNA Pol III (seperti U6 atau H1) atau promotor RNA Pol II (seperti CMV).

• Enzim Dicer alami memotong shRNA untuk membentuk dupleks siRNA yang diperlukan, yang kemudian terhubung dengan RISC.

• Ketika shRNA dipasok oleh vektor lentiviral, urutan pengkodean shRNA diintegrasikan ke dalam genom, dan efek knockdown ditransmisikan ke sel anak, memungkinkan pembungkaman gen yang sedang berlangsung.

• SiRNA sintetik antara 19 dan 21 pasangan basa dengan 2 overhang nukleotida juga dapat menginduksi RNAi.

• siRNA dapat diangkut ke sel dengan transfeksi lipid di samping teknik lain. Begitu berada di dalam sel, mereka langsung berasosiasi dengan RISC.

Apa itu Interferensi RNA?

Mekanisme ini menghambat gen melalui penargetan molekul RNA messenger. mRNA terdegradasi, menghalangi sintesis dan transkripsi protein. Hal ini dicapai dengan memasukkan RNA double-stranded (ds) ke dalam sel, yang kemudian dibelah dan diikat oleh RNA-induced silencing complex (RISC), yang pada akhirnya menghancurkan messenger RNA mRNA) dengan cara spesifik urutan menggunakan a small interfering RNA (siRNA) sebagai panduan.

Struktur shRNA (Short-hairpin RNA)

• shRNA adalah rantai polinukleotida RNA 20 hingga 25 bp di mana 4 hingga 11 nukleotida membuat loop seperti Short-hairpin yang mengikat molekul mRNA.

• Tidak seperti siRNA, ia tidak memiliki overhang dinukleotida di ujung 3′ OH.

• Selama translokasi, ia menyediakan situs pengenalan atau motif pengikatan untuk protein pengikat RNA dan mencegah penghancuran RNA.

• Loop struktural RNA sekunder membantu pelipatan RNA.

• Molekul beruntai ganda ini digunakan oleh para ilmuwan untuk beberapa tujuan, yang akan dibahas nanti dalam artikel ini. Tetapi pertama-tama, kita harus memahami bagaimana proses interferensi RISC dan RNA beroperasi.

• Para ilmuwan menggunakan dua bentuk shRNA dari sudut pandang teknis: RNA loop batang biasa (Short-hairpin) dan shRNA yang disesuaikan dengan microRNA. Keduanya memiliki komposisi, struktur, dan fungsi yang berbeda.

• RNA loop batang dasar terdiri dari daerah loop batang 19 hingga 29 bp, transkrip 50 hingga 70 nukleotida, dan overhang dinukleotida di ujung 3′. Ini berfungsi mirip dengan pra-microRNA dalam pemrosesan RNA. Ini menggunakan promotor RNA polimerase III.

• Sebaliknya, shRNA yang diadaptasi microRNA lebih besar dari yang standar. Panjangnya setidaknya 250 nukleotida. Ini mengandung ketidakcocokan seperti miRNA alami, yang menjelaskan mengapa ia lebih mirip miRNA asli.

• Selain itu, ia memiliki urutan seperti microRNA di kedua ujungnya.

• shRNA memang merupakan RNA untai tunggal, tetapi melalui pasangan basa antarmolekul, ia menghasilkan struktur untai ganda. Untai terpandu berisi urutan yang sama persis dengan mRNA target, yang panjangnya berkisar antara 21 hingga 29 nukleotida. Dan untai antisense yang melengkapi untai terpandu dengan benar. Interaksi ini membentuk struktur ds-shRNA.

 

Apa itu RISC (RNA interfering silencing complex)?

• Kompleks peredam interferensi RNA terdiri dari pemain dadu, siRNA atau shRNA, protein argonaute (Ago), dan protein pengikat dsRNA. shRNA, seperti siRNA, terdiri dari untai terarah dan untai penumpang.

• Setelah RISC mendeteksi dsRNA, ia mengenali untai terarah dan melokalisasinya pada untai mRNA yang melengkapinya.

• Protein 'Ago' yang ada di kompleks membelah hibrida di tengah, diikuti oleh pembelahan endo dan eksonuklease dari mRNA yang sama.

• mRNA terdegradasi menjadi fragmen yang lebih kecil dan tidak dapat diterjemahkan lebih lanjut. Akibatnya, produk gen yang dapat ditranskripsi oleh mRNA tidak dapat terbentuk. Short-hairpin RNA dapat dihasilkan secara artifisial dan digunakan secara in vivo.

• plasmid, vektor bakteri, atau vektor virus dapat digunakan untuk mempromosikan ekspresi shRNA. Namun, vektor virus tidak disarankan karena sifatnya yang menular.

• Karena tingkat degradasi mRNA yang rendah dan tingkat pergantian yang tinggi, terbukti bahwa shRNA lebih efektif daripada siRNA.

• shRNA dapat dihasilkan in vivo menggunakan vektor ekspresi yang dirancang khusus (dalam sel). Vektor ekspresi adalah alternatif yang sangat baik untuk meningkatkan proses sintetis yang dimediasi shRNA.

• Untuk ekspresi shRNA yang kuat dan efisien dalam sel, vektor ekspresi harus mengandung gen shRNA dan urutan promotor.

• Dalam interferensi RNA yang dimediasi shRNA, promotor RNA pol III atau DNA pol II biasanya digunakan. RNA pol III sangat disarankan karena laju ekspresi shRNA-nya lebih tinggi.

• Umumnya, promotor U6 dan H1 digunakan dalam vektor ekspresi untuk pengikatan spesifik RNA pol III untuk memanfaatkan RNA pol III. Sayangnya, promotor seperti CMV dan EF1 tidak terlalu efisien untuk ekspresi shRNA.

• (Ini semua masalah teknis! Anda hanya perlu menyadarinya; jangan khawatir jika Anda tidak dapat memahaminya!)

• Setelah vektor ekspresi telah diproduksi, itu dimasukkan ke dalam host atau genom target, di mana gen shRNA ditranskripsi oleh polimerase yang dipilih.

• Menggunakan transduksi yang dimediasi lentivirus, seluruh prosedurnya adalah sebagai berikut:

1. shRNA dimasukkan ke dalam sel dan ditranskripsi balik menjadi DNA.
2. Setelah integrasi gen dan promotor gen ke dalam genom inang, 'Drosha' memproses pra-miRNA dan pra-shRNA menggunakan polimerase.
3. Segera setelah itu, protein exportin5 mentransfer pra-shRNA ke sitoplasma sel. Di sini, pra-shRNA diubah menjadi shRNA matang. Protein pemain dadu memproses dsRNA seperti siRNA dan memotongnya sebelum memuatnya ke dalam RISC.
4. Meninggalkan untai penumpang di belakang, untai terpandu mengarahkan kompleks ke dan menempel pada mRNA yang sesuai.
5. Dimuat di RISC, 'protein Argo' memotong mRNA dan menghentikan sintesis protein yang ditentukan oleh mRNA tersebut. Mekanisme degradasi mRNA yang dimediasi shRNA digambarkan dalam diagram berikut.

 

interferensi RNA yang dimediasi shRNA

Rinci di bawah ini adalah proses umum untuk interferensi RNA yang dimediasi shRNA.

Langkah 1

• Pemilihan gen target; Minimal dua sekuens target harus dirancang untuk satu gen untuk meningkatkan kemanjuran RNA interference (RNAi).

Langkah 2

• Konstruksi shRNA komplementer mulai dari 19 hingga 27 pasangan basa hingga gen target, dengan shRNA 19bp menghasilkan hasil tertinggi.

Langkah 3

• Pada tahap selanjutnya, baik metode oligonucleotide-based cloning maupun metode PCR-based cloning digunakan untuk membuat vektor ekspresi shRNA.

• Karena presisi dan kecepatan amplifikasi PCR, teknik kloning berbasis PCR umumnya digunakan. Pelajari lebih lanjut tentang PCR: Pengantar Komprehensif untuk Polymerase Chain Reaction

• Di sini, satu basis yang tidak cocok dapat menghambat pembentukan Short-hairpin, oleh karena itu penting untuk memilih urutan dengan kapasitas tertinggi untuk pembentukan Short-hairpin.

Langkah 4

• Pada langkah ini, urutan promotor untuk RNA pol III atau DNA pol II dipilih untuk polimerisasi shRNA.

• Catatan: Transduksi yang dimediasi lentivirus kurang berbahaya daripada terapi yang dimediasi virus AAS, dan dapat menginfeksi sel yang menyelam dan tidak menyelam dengan baik, yang merupakan alasan lain untuk menggunakannya.

Langkah 5

• Setelah semua itu, vektor dengan shRNA untuk studi knockdown gen dimasukkan ke dalam sel atau sel target. Analisis PCR kuantitatif digunakan untuk mengetahui seberapa baik infeksi menyebar.

• PCR kuantitatif, juga disebut reverse transcription PCR, adalah cara untuk mengukur seberapa banyak gen yang digunakan. Juga, jika fungsi biologis gen target diketahui, efeknya dapat dipelajari, seperti apakah fenotipe ditekan atau diekspresikan secara berlebihan.

• Penggunaan retrovirus bukanlah ide yang baik, sehingga bakteri sekarang digunakan sebagai vektor.

Mekanisme shRNA (Short-hairpin RNA)

• Setelah vektor ditambahkan ke genom inang, polimerase II atau polimerase III, tergantung pada pilihan promotor, menyalin shRNA dalam nukleus.

• Produk ini dibuat oleh Drosha dan bertindak seperti pri-microRNA (pri-miRNA).

• Exportin 5 mengeluarkan pra-shRNA dari inti sel.

• Kemudian, Dicer mengerjakan produk ini dan menambahkannya ke RNA-induced silencing complex (RISC).

• Untaian indera (passenger) putus.

• Untai antisense (panduan) memberitahu RISC untuk pergi ke mRNA yang memiliki urutan yang cocok dengan untai panduan.

• Ketika kedua bagian tersebut cocok, RISC memotong mRNA. Ketika tidak ada kecocokan yang sempurna, RISC menghentikan mRNA agar tidak ditranslasikan.

• Dalam kedua situasi ini, shRNA mematikan gen target.

desain shRNA

shRNA biasanya dibuat dengan salah satu dari dua cara: dengan loop batang sederhana atau dengan format yang disesuaikan dengan microRNA.

shRNA loop batang sederhana

• shRNA dasar didasarkan pada pra-miRNA dan diklon ke vektor virus, di mana mereka disalin oleh promotor RNA Polymerase III (Pol III).

• shRNA dibuat sebagai molekul untai tunggal yang panjangnya 50–70 nukleotida dan memiliki struktur lingkar batang. Batang adalah bagian pasangan basa 19–29 dari RNA untai ganda yang terhubung ke loop oleh bagian RNA untai tunggal dan overhang pendek 3′.

• Setelah ditranskripsi, shRNA meninggalkan nukleus, di mana mereka dipotong di loop oleh Dicer nuklease di sitoplasma. Mereka kemudian masuk ke RISC, di mana mereka memberi tahu nuklease untuk memotong mRNA komplementer dan membuangnya.

microRNA diadaptasi shRNA

• shRNA yang diadaptasi microRNA terdiri dari struktur batang shRNA dengan ketidakcocokan seperti microRNA dan urutan loop dan mengapit dari microRNA endogen.

• shRNA yang diadaptasi microRNA disalin dari promotor RNA Polymerase II (Pol II), dipotong oleh enzim RNase III Drosha endogen dalam nukleus, dan kemudian dikirim ke sitoplasma di mana mereka diproses oleh Dicer dan dimuat ke dalam kompleks RISC.

• Penelitian telah menunjukkan bahwa menggunakan perancah microRNA yang dapat dipecah oleh Drosha dan Dicer dapat membuat pemrosesan lebih efisien dan tidak terlalu berbahaya untuk RNAi in vivo.

aplikasi shRNA

• shRNA memungkinkan untuk membungkam gen untuk waktu yang lama.

• Transduksi shRNA berbasis virus memberikan akses ke sel yang sulit untuk ditransfeksi dengan strategi berbasis lipid kationik tradisional, seperti sel primer dan sel saraf.

• Menggunakan kumpulan konstruksi pembungkaman, shRNA yang dibuat dari virus juga telah digunakan untuk melihat bagaimana gen bekerja di seluruh genom.

• Layar yang dikumpulkan atau disusun sekarang banyak digunakan untuk melakukan layar throughput tinggi untuk menemukan gen yang diperlukan untuk hal-hal seperti kelangsungan hidup dan proliferasi sel kanker, komponen jalur penekan tumor, modulator jam sirkadian mamalia, penekan transisi epitel-mesenkim, mediator host HIV -1 replikasi, dan pengatur migrasi sel. Penyaringan RNAi yang dikumpulkan juga telah digunakan untuk mencari cara kerja gen pada model hewan untuk mempelajari lebih lanjut tentang biologi in vivo.

Aplikasi terapeutik shRNA

• shRNA telah digunakan untuk mengobati kanker prostat, melanoma, dan penyakit yang merusak sel saraf. Mereka juga sedang dipelajari dengan cermat untuk melihat apakah mereka dapat digunakan untuk mengontrol aktivitas gen target pada penyakit jangka panjang lainnya.

• Huang dkk. menggunakan model tikus untuk menguji bagaimana protein prolyl hydroxylase-2 (PHD2) dapat digunakan dengan shRNA untuk mengobati iskemia miokard. Pencitraan molekuler yang tidak melukai tikus menunjukkan bahwa memblokir PHD2 dengan shRNA membuat angiogenesis jauh lebih baik.

• Studi ini juga menemukan bahwa fragmen sense dan antisense shRNA diekspresikan dengan cara yang sama ketika didorong oleh dua promotor H1. Down-regulation dari gen PHD2 pada tikus disebabkan oleh efek knock-down dari fragmen sense dan antisense ini. Pada gilirannya, penurunan regulasi PHD2 mengaktifkan protein dan gen angiogenik yang merupakan bagian dari jalur respons hipoksia.

• Penelitian juga menunjukkan bahwa shRNA yang diberikan secara retroviral dapat menghentikan penyebaran human immunodeficiency virus tipe 1 (HIV-1) lebih lama daripada pengobatan HIV lainnya.

• Terapi gen ShRNA juga telah diuji pada tikus non-obesitas dengan sistem kekebalan lemah yang disuntik dengan sel CD44+ CD24- untuk melihat apakah itu dapat menghentikan pertumbuhan tumor payudara manusia. Diketahui bahwa sel CD44+ CD24- adalah penyebab tumor payudara, jadi menolak CD44 dapat menghentikan pertumbuhan tumor.

• Dalam sebuah penelitian yang dilakukan oleh Pham et al., ditemukan bahwa kombinasi vektor lentiviral CD44 RNA dan doxorubicin menghentikan pertumbuhan tumor dengan sangat baik dan aman. Dengan mengejar sel induk kanker, ini bisa menjadi cara yang baik untuk mengobati kanker payudara.

Tantangan dalam terapi yang dimediasi shRNA

• Sel-sel pasien mungkin membuat respons imun yang kuat terhadap shRNA: Itu sangat masuk akal, bukan? Pada awalnya, sel mungkin melihat shRNA kita sebagai dsDNA asing, berbahaya, dan patogen dan memicu respons imun yang kuat untuk menyingkirkannya.

• Dapat dikatakan di luar kendali: Vektor ekspresi memiliki ekspresivitas yang lebih tinggi, yang berarti lebih banyak shRNA yang dapat dibuat. sel tidak dapat menanganinya dengan cukup baik.

• mRNA yang salah sedang diproses: Seluruh proses harus jelas dan fokus pada tujuan. shRNA hanya bekerja pada mRNA yang kita inginkan. Ketika diekspresikan secara berlebihan, sel dengan tingkat kejenuhan RISC yang tinggi memproses mRNA yang salah, bukan mRNA target. Spesifisitas target bisa hilang jika Anda mengatakan terlalu banyak, yang merupakan masalah besar lainnya.

• Efek shRNA tidak tepat sasaran: Off-target berarti shRNA kami bekerja pada mRNA yang bukan yang ingin kami ubah. Seperti yang telah kami katakan, teknologinya baru dan belum sepenuhnya dipahami atau didokumentasikan. Karena itu, ada beberapa laporan tentang efek di luar target.

• Terapi belum cukup dicoba: Terapi belum sepenuhnya diuji, dan mungkin tidak bekerja sesuai rencana. Ini juga dapat mengubah cara gen lain diekspresikan.

• Transfektivitas rendah: Ini berarti bahwa terapi shRNA tidak bekerja dengan baik dalam mentransfer gen. Secara khusus, sel-sel yang tidak membelah dan sel-sel kekebalan lainnya tidak dapat ditransfusikan secara akurat dan baik. Dibutuhkan berbulan-bulan untuk menyiapkan sel-sel shRNA-positif untuk digunakan dalam transplantasi.

• Tidak dapat bekerja untuk semua jenis sel: Masalah lain dengan terapi ini adalah tidak bekerja untuk semua jenis sel. Ini berarti bahwa shRNA tidak mengejar semua jenis sel. Ini dapat bekerja dengan baik dengan beberapa garis sel tetapi tidak sama sekali dengan yang lain.

References

Tsujiuchi, T., Miller, A. D., Wakabayashi, T., & Natsume, A. (2014). RNA Interference Therapeutics for Tumor Therapy. Gene Therapy of Cancer, 393–408. doi:10.1016/b978-0-12-394295-1.00027-5

Moore CB, Guthrie EH, Huang MT, Taxman DJ. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods Mol Biol. 2010;629:141-58. doi: 10.1007/978-1-60761-657-3_10. PMID: 20387148; PMCID: PMC3679364.

Sheng, P., Flood, K. A., & Xie, M. (2020). Short Hairpin RNAs for Strand-Specific Small Interfering RNA Production. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 8. doi:10.3389/fbioe.2020.00940