Elektroforesis DNA

Read Also

        DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain.

            Lamdji (1998, dalam wahyuni: 2009) mengatakan bahwa penelitian keragaman genetik tanaman buah merupakan salah satu kegiatan penting untuk mendukung pemuliaan tanaman. Perbedaan tanaman dapat dideteksi melalui beberapa penanda, antara lain dengan pola pita DNA. Dalam Wahyuni (2009), Nicholl (1993) dan  Surzycki (2000)  pun menyatakan  ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.

            Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

            Untuk mendeteksi potongan-potongan DNA berupa bands-DNA pada gel agarose digunakan pewarna yang mengandung fluoresen dengan konsentrasi rendah, seperti intercalating agent ethidium bromide (EtBr). Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator (Fatchiyah,2006).

            Fachiyah (2006) pun mengemukakan beberapa faktor yang mempengaruhi Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak menembus gel agarose, sebagai berikut:

1.    Ukuran molekul DNA

Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional  log-10 dari jumlah pasangan basa.

2.    Konsentrasi gel agarose

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: logm=logmo-Kr_T dimana mo adalah free electrophoresis mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan  _T adalah gel konsentrasi serta m adalah electrophoretic mobility DNA.

Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA

No	Konsentrasi Gel Agarose (%)	Effisiensi range Pemisahan pada DNA linier (kb)
1	0.3	60-5
2	0.6	20-1
3	0.7	10-0.8
4	0.9	7-0.5
5	1.2	6-0.4
6	1.5	4-0.2
7	2.0	3-0.1

3.      Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:

·      konsentrasi gel agarose

·      kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan

·      densitas kembaran superheliks pada bentuk I

·      pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III

·      tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I

·      konsentrasi EtBr kritis antara 0.1mg/ml-0.5ml/mg

4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris

Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA ± 2kb pada gel agarose bergerak ± 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.

5. Komposisi basa DNA atau temperature

Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil pada temp. 4-30°C. Dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar

6. Keberadaan pewarna DNA

Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA ± 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. PERHATIAN! EtBr ini powerful mutagen, pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan lindungi mata anda dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.

7. Komposisi buffer elektroforesis

Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan gel agarose. Missal:

·      Tris-acetate; umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.

·      Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarose kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarose.

          sampel diambil dari sampel molekul  DNA yang telah dilarutkan dalam TE sebanyak 30 mikroliter dan telah disimpan pada suhu 4˚C selama 24 jam.  Lalu penambahan Loading dye  ke dalam sampel dengan perbandingan 5 bagian sampel DNA dan 2 bagian loading dye.

          Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk linear dan bermuatan negatif pada sisi luarnya sehingga pada saat dielektroforesis akan menuju ke kutub positif secara seragam. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dideteksi. Dalam praktikum ini kami menggunakan Etidium bromida sebagai zat pewarnanya,. Etium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna orange fluoresance yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet.

          Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. Penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Dalam Hasil pengamatan terlihat bahwa terdapat fragmen DNA yang terlihat terurai dan tidak terurai. Semakin sedikit DNA yang terurai, maka semakin baik hasil elektroforesis DNA nya.