Vaksin Berbasis mRNA

Read Also

Konsep terapi berbasis mRNA muncul lebih dari tiga dekade lalu ketika Dimitriadis, Malone et al, dan Wolff et al. memberikan bukti pertama bahwa mRNA yang diproduksi secara endogen (diekstraksi dari sel) dan in vitro transcribed (IVT) dapat dikirim ke sel dan hewan untuk ekspresi protein. Meskipun hasil yang menggembirakan dari penelitian selanjutnya, keterbatasan utama seperti peradangan yang kuat dan pengurangan translasi in vivo karena waktu paruh mRNA yang pendek dengan cepat dikenali. Inhibisi translasi protein yang dimediasi inflamasi, ketidakstabilan fisikokimia, peningkatan sensitivitas terhadap nuklease, dan transfeksi yang buruk semakin membatasi aplikasi klinis dan terapeutik potensial (misalnya, penggantian protein) dari platform. Mengatasi kekurangan ini secara signifikan meningkatkan platform yang memungkinkan keberhasilan pengembangan vaksin dan/atau adjuvant (misalnya, platform CureVac RNActive®). Martinon dkk. dan Conry dkk. menunjukkan bahwa mRNA yang dimuat ke dalam liposom menimbulkan antigen-specific cytotoxic T lymphocytes (Tc) dan respons humoral yang membuka jalan bagi pengembangan vaksin mRNA dan uji coba manusia awal.

Kemajuan teknologi terkini, termasuk penggabungan nukleosida yang dimodifikasi ke dalam mRNA in vitro transcribed (IVT) dan penghilangan kontaminan menggunakan kromatografi pemurnian yang dipelopori oleh Kariko dan Weissman, sangat penting untuk pengembangan platform vaksin mRNA yang aman dan kuat. Perbaikan lebih lanjut dalam rekayasa urutan dan optimasi kodon, dan inovasi dalam kelompok tutup dan strategi pembatasan, selain evolusi sistem pengiriman yang kuat dan relatif aman seperti nanopartikel lipid, telah secara signifikan memajukan pengembangan dan persetujuan peraturan vaksin berbasis mRNA. Misalnya, modifikasi nukleosida dan eliminasi kontaminan RNA untai ganda yang dihasilkan selama IVT telah membatalkan efek adjuvant intrinsik dari mRNA IVT, meningkatkan tolerabilitas, dan meningkatkan ekspresi antigen/protein (translation) beberapa kali lipat. cap analogs dan capping strategies baru telah meningkatkan hasil molekul mRNA yang dibatasi dengan benar dan mengurangi pengenalan oleh sensor imun bawaan sitoplasma (misalnya, RIG-I dan MDA5), secara bersamaan meningkatkan terjemahan, keamanan, dan harga barang.

Vaksin mRNA dapat dibagi menjadi tiga kategori utama: (i) mRNA konvensional, (ii) self-amplifying mRNA (SAM), dan (iii) circular RNA (circRNA). Konvensional in vitro transscribed (IVT) mRNA relatif sederhana dalam arsitekturnya dan diproduksi dengan hasil tinggi menggunakan sintesis enzimatik bebas sel yang diarahkan pada template. DNA plasmid linier biasanya digunakan sebagai cetakan untuk sintesis mRNA, dan mengandung sekuens promotor, 5′ dan 3′ untranslated region (UTRs), dan gen yang diinginkan. Polyadenine tail (PolyA), elemen penting dalam stabilitas dan ekspresi mRNA dapat direkayasa ke dalam plasmid atau ditambahkan secara enzimatik setelah sintesis. Struktur tutup 5′ ditambahkan secara ko-transkripsi (misalnya, CleanCap™) atau secara enzimatik (misalnya, sistem Vaccinia Capping) untuk meningkatkan stabilitas mRNA dan ekspresi protein, dan mengurangi imunogenisitas (misalnya, intracellular RIG-I sensing).

Tergantung pada penggunaan modifikasi nukleosida selama pembuatan dan sintesis, platform vaksin mRNA konvensional dapat dibagi lagi menjadi mRNA yang dimodifikasi nukleosida atau tidak dimodifikasi (Gambar). Modifikasi nukleosida telah terbukti penting dalam keberhasilan penerapan klinis vaksin mRNA konvensional. Pentingnya modifikasi nukleosida dalam memastikan keberhasilan platform ini ditunjukkan oleh data sementara dari CureVac yang menunjukkan hasil yang mengecewakan (perlindungan 47% dibandingkan dengan lebih dari 94% dengan vaksin Pfizer/BioNTech dan Moderna). Ini kemungkinan karena penggunaan mRNA yang tidak dimodifikasi, yang memiliki imunogenisitas bawaan yang lebih tinggi daripada mRNA yang dimodifikasi nukleosida, sehingga membatasi dosis hingga 12 g dalam uji coba CureVac dibandingkan dengan 30 dan 100 g untuk uji coba Pfizer/BioNTech dan Moderna masing-masing.

Gambar. Desain vaksin RNA konvensional, self-amplifying, trans-amplifying, dan circular. 5′ 7-methylguanosine triphosphate (m7G), 5′ Untranslated region (5′UTR), 3′ untranslated region (3′UTR), dan poly A tail adalah umum di semua desain RNA. (A) Imunogen vaksin pengkodean mRNA konvensional yang tidak dimodifikasi, dan dimodifikasi nukleosida. (B) RNA yang menggandakan diri mengkodekan gen replika, promotor subgenomik, dan imunogen vaksin. Gen replika (misalnya, Alphavirus nsP1-4) mengkode untuk RNA dependent RNA polymerase complex (RdRP) yang mengenali urutan promotor subgenomik dan memperkuat imunogen vaksin. (C) Trans-amplifying mRNA bergantung pada konsep yang sama dari mRNA self-amplifying tetapi menggunakan dua transkrip RNA yang berbeda: RNA konvensional yang mengkodekan gen replika dan, RNA yang mengkodekan promotor subgenomik bersama dengan imunogen vaksin. (D) RNA melingkar yang direkayasa untuk memungkinkan ekspresi protein melalui internal ribosomal entry sites (IRES) (misalnya, virus ensefalomiokarditis IRES) dan/atau penggabungan modifikasi nukleosida spesifik dalam 5′ UTR.

Self-amplifying mRNA direkayasa untuk memasukkan mesin molekuler yang diturunkan dari virus seperti replika yang diturunkan dari alphavirus dan conserved sequence elements (CSEs) untuk memungkinkan amplifikasi intraseluler dari urutan mRNA. Arsitektur SAM yang khas dibangun dari kaset ekspresi (misalnya, promotor sub-genomik dan antigen yang diinginkan) yang dikloning di antara sekuens yang mengkode protein nonstruktural turunan alfavirus 1-4 (misalnya, VEEV nsP1-4) dan ekor poli adenosin (Gambar). Protein nsP1-4 berkumpul menjadi kompleks RNA polimerase (RdRP) yang bergantung pada RNA yang mengenali conserved sequence elements (CSE) yang termasuk dalam desain konstruksi (Gambar). Ini kemudian mereplikasi vaksin mRNA di sitoplasma, menghasilkan transkripsi dan ekspresi protein yang efisien dan berumur panjang. SAM biasanya berukuran besar (misalnya, 6000-12.000 nukleotida), dan pembuatannya lebih kompleks dan menantang dibandingkan dengan vaksin mRNA konvensional karena hasil yang rendah, kesulitan dalam pemurnian, dan kerentanan terhadap autokatalisis dan degradasi fisik.

Format SAM tidak dapat menerima modifikasi nukleosida karena gangguan interaksi antara RdRP dan urutan modifikasi nukleosida yang mengakibatkan berkurangnya amplifikasi mRNA dalam sel target. Oleh karena itu, respons interferon tipe I yang kuat karena endosom (misalnya, TLR3, 7, dan 8) dan penginderaan sitoplasma (misalnya, RIG-1, PKR, dll.) dari nukleosida yang tidak dimodifikasi dalam SAM menciptakan rintangan potensial untuk terjemahan klinis. Namun, dosis vaksin dengan SAM bisa 100 kali lipat lebih rendah daripada yang digunakan dengan vaksin mRNA konvensional dan oleh karena itu dapat menawarkan perlindungan dari penyakit dengan efek samping yang lebih sedikit dalam pengaturan klinis. Data praklinis menggunakan mRNA SAM yang dikembangkan oleh Imperial College dan terapi Acuitas yang diberikan pada dosis yang sangat rendah (10 ng, dorongan utama) menunjukkan respons sel dan antibodi yang kuat pada tikus dan sekarang dalam evaluasi klinis pada dosis 300–1000x lebih rendah daripada yang digunakan dalam vaksin mRNA modifikasi nukleosida yang disetujui.

Trans-amplifying mRNAs (transmRNA) disiapkan dengan memisahkan SAM menjadi dua transkrip yang berbeda diikuti dengan pengiriman bersama ke dalam sel target diperkenalkan untuk pembuatan yang lebih mudah. Dalam pendekatan ini, gen nsP1-4 dikodekan menjadi transkrip konvensional yang terpisah dan dikirimkan bersama dengan transkrip yang berisi CSE, promotor subgenomik, dan urutan antigen (Gambar). Ekspresi nsP1-4 dan perakitan selanjutnya ke dalam RdRP memungkinkan amplifikasi trans-trans (pada molekul yang berbeda) dari transkrip penyandian antigen. Pendekatan ini terbukti menginduksi respon imun yang kuat pada tikus dan secara efektif mengatasi beberapa keterbatasan SAM yang diuraikan di atas.

Circular RNA (circRNA) adalah kelas RNA untai tunggal non-coding yang dihasilkan melalui peristiwa splicing non-kanonik yang dikenal sebagai back-splicing dalam sel eukariotik. circRNAs telah direkayasa untuk memungkinkan ekspresi protein melalui internal ribosomal entry sites (IRES) dan/atau penggabungan modifikasi nukleosida spesifik dalam 5′ UTR (Gambar). Platform baru ini telah terbukti menghasilkan terjemahan yang kuat dan stabil dalam sel eukariotik karena waktu paruh transkrip yang diperpanjang (misalnya, penurunan resistensi nuklease). Studi terbaru menunjukkan bahwa circRNA dapat menghindari sensor imun intraseluler seperti RIG-I tanpa modifikasi nukleosida. Qu dkk. menunjukkan bahwa circRNA menghasilkan respons imun seluler dan humoral antigen spesifik CD4+ dan CD8+ yang kuat pada tikus terhadap SARS-CoV-2 dan varian yang muncul, oleh karena itu, memberikan bukti konsep untuk aplikasi vaksin.

Respon imun terhadap vaksin mRNA sangat bergantung pada sistem pengiriman, imunogenisitas antigen yang dikodekan, dan umur panjang dan lokalisasi ekspresi antigen di subseluler. Pemberian vaksin mRNA secara intramuskular dan intradermal sangat imunogenik dan menginduksi produksi sitokin dan kemokin lokal yang memulai perekrutan segera neutrofil, monosit, dan sel lain untuk memicu respons imun. Injeksi mRNA encapsulated in lipid nanoparticles (mRNA-LNP) telah terbukti menginduksi infiltrasi kuat neutrofil, monosit, dan sel dendritik serta aktivasi sitokin pro-inflamasi (misalnya, IL-1β, PTX3, NLRP3, IL- 6, GM-CSF) dan kemokin (misalnya, CXCL-10, CXCL-11, MIP-2) pada tikus dan kera rhesus. Berbeda dengan synDNA, vaksin mRNA secara langsung diterjemahkan dalam sitoplasma, dan protein berikutnya diproses dan disajikan pada MHC-I dan II, diikuti oleh presentasi ke sel T CD8+ dan sel T helper CD4+ di kelenjar getah bening yang mengering. Karena mRNA tidak perlu memasuki nukleus, kinetika ekspresi jauh lebih cepat, dengan onset biasanya memuncak pada 4 jam setelah pemberian.

vaksin mRNA yang digunakan dalam studi praklinis dan klinis menginduksi respons miring Th1, dan induksi kuat dari respons germinal center (GCs) dan T-follicular helper cells (Tfh). Peningkatan reaksi GC dan proliferasi/aktivasi Tfh dibandingkan dengan vaksin berbasis protein yang tidak aktif dan rekombinan kemungkinan disebabkan oleh profil dan besarnya respons sitokin yang diinduksi oleh adjuvant (LNP versus adjuvant tradisional seperti tawas atau MF59) dan ekspresi antigen yang berkelanjutan meningkat sampai sepuluh hari setelah injeksi intramuskular dan intradermal, menyebabkan presentasi antigen lebih lama.

Dibandingkan dengan platform vaksin virus dan synDNA, mRNA hampir tidak menimbulkan risiko integrasi ke dalam genom. vaksin mRNA juga lebih hemat biaya, dan relatif lebih mudah dibuat. Masalah dengan stabilitas jangka panjang pada suhu kamar, ketergantungan pada transportasi rantai dingin ultra-rendah, reaktivitas tinggi, dan jendela pengaman yang relatif sempit adalah keterbatasan utama platform. Pengembangan lipid ampuh dan biodegradable, serta formulasi baru, kemungkinan besar akan mengatasi kekurangan untuk platform baru.