Desain dan Pengembangan mRNA Transkripsi In Vitro

Read Also

Vaksin Messenger RNA menerapkan mRNA IVT sebagai blueprint untuk memproduksi antigen vaksin in vivo, pada pasien. Antigen spesifik patogen yang ditranskipsikan akan menginduksi respon imun spesifik, tergantung pada jenis sel yang ditransfeksi, dan imunogenisitas produk mRNA dan antigen yang dikodekan.

Sintesis mRNA in vitro biasanya dimulai dengan kloning antigen target menjadi plasmid DNA dan linierisasi berikutnya, meskipun produk PCR dan oligonukleotida sintetik juga dapat berfungsi sebagai templat untuk reaksi transkripsi in vitro cell-free dengan RNA polimerase rekombinan dan nukleosida trifosfat. Setelah transkripsi, templat DNA dihilangkan menggunakan RNase-free DNases, dan untuk meningkatkan stabilitas mRNA dan efisiensi translasi, produk transkripsi ditutup secara enzimatik. Akhirnya, produk mRNA dimurnikan untuk menghilangkan sisa templat DNA, double-stranded RNA, dan kontaminasi lainnya oleh HPLC (Gambar 1). Kualitas transkrip mRNA merupakan faktor kritis, memerlukan pengujian untuk stabilitas, integritas, identitas, kemurnian, dan homogenitas, seperti pengujian untuk respon imun bawaan yang diinginkan sebelum pengujian hewan.

Gambar 1. Tahapan produksi Messenger RNA: (1) Konstruksi DNA diklon pada bakteri Escherichia coli (E. coli), kemudian dimurnikan dan diamplifikasi; (2) konstruksi DNA linier ditranskripsi; (3) transkrip ditutup selama transkripsi atau ditutup setelah transkripsi; dan (4) dimurnikan dengan kromatografi.

Biasanya, IVT mRNA terdiri dari protein-encoding open reading frame (ORF) yang diapit oleh dua untranslated regions (UTRs), untuk mendukung transkisi (Gambar 2). signal peptide (SP)dapat ditambahkan ke ORF untuk memfasilitasi sekresi kandidat antigen vaksin yang dikodekan. Transkrip selanjutnya harus mengandung poly(A) tail untuk meningkatkan stabilitas intraseluler dan efisiensi translasi. Telah ditunjukkan bahwa sementara peningkatan panjang poly(A) tail umumnya meningkatkan efisiensi pembentukan polisom, yang mengarah pada peningkatan ekspresi protein, tampaknya ada panjang optimal 120 dan 150 nukleotida. Pada ujung 5′, RNA ditutup dengan 7-methyl-guanosine triphosphate (m7G) untuk melindungi terhadap RNase. Karena adanya dua 3′-OH bebas pada kedua bagian guanin dari struktur cap, kira-kira sepertiga dari mRNA memiliki cap yang tergabung dalam reverse orientation. Struktur reverse cap ini mengikat ke eIF4E, protein cap pengikat, dan karena itu menurunkan efisiensi translasi. Untuk mengatasi masalah tersebut, anti-reverse cap analogs (ARCAs) telah dikembangkan. ARCA hanya memiliki satu gugus 3′-OH, yang menghambat penggabungan dalam reverse orientation yang terlihat dengan analog cap. Peningkatan lebih lanjut dari efisiensi pembatasan dilakukan oleh CleanCap®, metode pembatasan transkripsional. CleanCap® menghasilkan struktur Cap1 yang terjadi secara alami, yang menghasilkan peningkatan efisiensi transkripsi mRNA dibandingkan dengan analog cap ARCA.

Gambar 2. Konstruksi mRNA tipikal dengan daerah pendukung yang tidak ditranskripsikan, poly(A) tail, dan peptide sequence sinyal opsional yang melekat pada coding sequence.

Beberapa kelompok telah mengembangkan produk vaksin mRNA yang mereplikasi diri atau mereplikasi untuk membuat transfeksi mRNA lebih efisien. Konstruksi mRNA yang memperkuat diri termasuk bagian non-struktural dari genom virus untai positif, misalnya virus sindbis, virus Semliki Forest, atau virus ensefalitis kuda Venezuela, yang mengkodekan sistem replikasi RNA mereka sendiri (Gambar 3). Urutan protein struktural virus diganti dengan urutan antigen yang diinginkan. Platform mRNA ini memiliki kemampuan replikasi diri melalui sintesis kompleks RNA polimerase yang bergantung pada RNA, yang mengarah ke banyak salinan mRNA pengkode antigen dan tingkat antigen target heterolog yang lebih tinggi. Dalam sebuah studi khusus tentang vaksin mRNA melawan influenza, vaksin mRNA yang memperkuat diri sendiri menghasilkan titer antibodi yang tinggi in vivo setelah menyuntikkan hanya 50 ng mRNA, jumlah yang 40 kali lebih rendah daripada yang digunakan untuk transfeksi konvensional. Sementara sistem pengiriman dan transfeksi dapat digunakan untuk meningkatkan stabilitas dan penyerapan seluler dari RNA yang memperkuat diri, keuntungan dari vaksin mRNA yang memperkuat sendiri adalah bahwa mereka tidak benar-benar memerlukan sistem pengiriman tambahan. Karena desain dari vektor alphavirus dan ukurannya yang lebih besar (9-11 kilobase), RNA self-amplifying telanjang diambil oleh sebagian besar sel yang mewakili antigen. Perlu dicatat bahwa produksi dan pemurnian mRNA yang lebih panjang lebih menantang dan amplifikasi mRNA dalam sel inang dapat menghasilkan respon inflamasi yang kuat, membatasi produksi antigen. Selain itu, respon imun memori terhadap protein replikasi dapat membatasi penggunaan berulang, mirip dengan platform vaksin lain yang menerapkan vektor virus.

Gambar 3. Atas: konstruksi mRNA yang memperkuat diri sendiri: urutan empat non-structural proteins (nsPs) dari virus alfa disisipkan di antara wilayah pertama untranslated region (UTR) dan gene of interest (GOI); kiri bawah: Skema sel yang ditransfeksi dengan vaksin mRNA biasa atau mRNA yang memperkuat sendiri, menggambarkan hasil yang lebih tinggi dari protein yang ditraskrisikan oleh konstruksi yang memperkuat sendiri; kanan bawah) Keuntungan dan kerugian dari mRNA yang memperkuat diri.