Terobosan metode gene silencing kolesterol selama satu tahun pada tikus, tanpa kerusakan DNA

Read Also

Dalam penelitian terbaru yang dipublikasikan di jurnal Nature, para ilmuwan menggunakan model tikus untuk menguji apakah pembungkaman gen in vivo dipertahankan setelah pengiriman sementara dan ekspresi penekan transkripsional yang direkayasa dengan menargetkan gen yang terlibat dalam menjaga homeostasis kolesterol.

Latar belakang

Salah satu metode yang sangat menjanjikan dalam mengobati kelainan genetik adalah penyuntingan epigenetik, yaitu gen dapat dibungkam tanpa mengubah deoxyribonucleic acid (DNA) sequence primernya. Pengeditan epigenom melibatkan editor desainer dengan domain efektor yang diperoleh dari penekan transkripsional yang terjadi secara alami dan ditargetkan ke domain pengikatan DNA yang dapat diprogram. Domain pengikat DNA tersebut mencakup zinc-finger proteins (ZFPs) dan transcription activator-like effectors (TALEs).

Penekan transkripsional dari kotak terkait Krüppel atau keluarga KRAB telah dieksplorasi secara luas untuk pembungkaman gen dan telah menunjukkan kemampuan untuk menginduksi represi gen yang kuat baik dalam penelitian in vivo maupun in vitro pada berbagai jenis sel. Pembungkaman gen oleh editor berbasis KRAB ini dilakukan dengan menggunakan enzim pengubah histon. Namun, penggunaan editor berbasis KRAB dalam sel somatik tidak stabil, dan penggunaan vektor virus untuk mengekspresikan editor ini secara stabil meningkatkan bahaya mutagenesis.

Oleh karena itu, tim peneliti ini mengembangkan represor transkripsional rekayasa yang mengandung, bersama dengan KRAB, domain katalitik enzim de novo DNA-methyltransferase A (DNMT3A) dan kofaktornya yang mirip DNMT3A, yang secara spesifik dan tahan lama dapat membungkam gen endogen.

Tentang penelitian

Dalam penelitian ini, para peneliti menyelidiki apakah ekspresi sementara dari penekan transkripsional yang direkayasa secara in vivo dapat menyebabkan pembungkaman gen yang berkelanjutan. Untuk melakukan hal ini, mereka menggunakan model tikus dan menargetkan gen Pcsk9, yang mendorong degradasi reseptor lipoprotein densitas rendah pada membran plasma hepatosit hati, sehingga mengendalikan kadar kolesterol yang bersirkulasi.

Penekan transkripsional yang direkayasa menargetkan wilayah penambah-promotor gen selama pembungkaman epigenetik dan secara bersama-sama menghilangkan dan menyimpan tanda histone pengaktifan dan represi di wilayah tersebut. Selain itu, metilasi DNA di lokasi di mana pasangan nukleotida sitosin dan guanin terjadi secara seri, yang dikenal sebagai pulau CpG, juga meningkat karena aksi metiltransferase endogen. Proses ini menentukan ketahanan dari pembungkaman epigenetik.

Di sini, para peneliti merekayasa garis sel hepatoma dari tikus yang melaporkan aktivitas transkripsi tingkat sel tunggal untuk gen Pcsk9. Garis sel ini digunakan untuk memilih kombinasi represor transkripsional yang direkayasa tiga kali lipat untuk tiga jenis platform domain pengikatan DNA yang dapat diprogram yang menargetkan pulau CpG yang berisi promotor Pcsk9. Tiga platform domain pengikatan DNA yang dapat diprogram termasuk ZFPs, TALEs, dan cluster yang dinonaktifkan secara katalitik yang secara teratur diselingi clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (dCas9).

Nanopartikel lipid yang membawa messenger ribonucleic acid (mRNA diberikan kepada tikus. Sampel plasma dari tikus yang diobati dianalisis untuk mengetahui kadar protein PCSK9. Selain itu, sampel DNA genom digunakan untuk analisis molekuler in vivo, dan hepatosit yang dimurnikan digunakan untuk mengukur efisiensi dalam pengeditan dan pengeditan epigenomik melalui pengurutan dalam yang ditargetkan atau uji deteksi endonuklease T7.

Selain itu, kombinasi represor transkripsional yang direkayasa rangkap tiga diubah menjadi represor transkripsional yang direkayasa dan dikembangkan — sebuah molekul lengkap untuk mengurangi kompleksitas molekuler platform.

Hasil

Hasilnya melaporkan bahwa ZFP dipilih sebagai platform domain pengikatan DNA yang dapat diprogram dan memiliki kinerja paling efisien untuk pembungkaman epigenetik gen Pcsk9 pada tikus. Selain itu, satu pemberian editor mRNA di dalam nanopartikel lipid berhasil menurunkan kadar protein PCSK9 dalam plasma hingga setengahnya, dan efek ini dipertahankan selama hampir satu tahun pada model tikus.

Meskipun ada regenerasi hati yang dipaksakan pada tikus-tikus ini melalui hepatektomi parsial, pembungkaman gen Pcsk9 dan tanda histone represif epigenetik tetap ada, menunjukkan bahwa keadaan epigenetik yang dipasang oleh penekan transkripsional yang direkayasa dapat diwariskan. Selain itu, penekan transkripsional yang direkayasa, yang disebut EvoETR, memiliki profil spesifisitas yang tinggi, dan pengurangan kadar protein PCSK9 yang bersirkulasi sebanding dengan hasil dari metode penyuntingan gen konvensional.

Dibandingkan dengan interferensi asam ribonukleat (RNAi), metode pembungkaman gen ini terbukti lebih efisien dan berkelanjutan karena hanya diperlukan satu kali pemberian untuk mendapatkan efek selama setahun, sedangkan RNAi memerlukan beberapa kali pemberian. Penggunaan EvoETR juga memiliki keuntungan tambahan karena tidak menyebabkan kerusakan DNA, tidak seperti metode pengeditan genom lainnya, dan mencegah genotoksisitas.

Kesimpulan

Secara keseluruhan, temuan menunjukkan bahwa penggunaan kombinasi represor transkripsional yang dapat diprogram, terutama EvoETR all-in-one yang disederhanakan, berhasil membungkam gen Pcsk9 pada tikus dan mengurangi kadar protein PCSK9 dalam plasma yang bersirkulasi selama hampir satu tahun. Metode ini menghindari proses genotoksik yang menginduksi kerusakan DNA yang diperlukan oleh metode pengeditan gen lainnya. Hasil ini menyoroti potensi aplikasi terapeutik in vivo dari pembungkaman epigenetik.

Journal reference:

Cappelluti, M. A., Poeta, M., Valsoni, S., Quarato, P., Merlin, S., Merelli, I., & Lombardo, A. (2024). Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. DOI: 10.1038/s41586024070878, https://www.nature.com/articles/s41586-024-07087-8