Metode hitungan cawan

Read Also

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah bila sel microbe yang masih hidup ditumbuhkan pada medium, maka microbe tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung, dan kemudian dihitung tanpa menggunakan mikroskop. Metode ini merupakan cara yang paling sensitive untuk menentukan jumlah jasad renik, dengan alasan:

(1). Hanya sel yang masih hidup yang dihitung

(2). Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus

(3). Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sal mikroba yang mempunyai penampakan spesifik.

Selain keuntungan-keuntungan tersebut, metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai berikut:

- Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya, karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni.

-  Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda.

-  Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.

Langkah–langkah yang harus diperhatikan pada  metode hitungan cawan adalah:

1. Pengenceran

            Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml, per g atau per cm permukaan, memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri, sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah di antara 30 dan 300. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dan seterusnya.

            Pengambilan contoh dilakukan secara aseptic dan pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan kira-kira sebanyak 25 kali untuk memisahkan sel-sel mikroba yang bergabung menjadi satu.

            Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan fosfat buffer, larutan garam fisiologis atau larutan Ringer.

2. Cara Pemupukan

            Prinsip metode hitungan cawan adalah sebagai berikut: jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.

Beberapa metode hitungan cawan yaitu metode tuang (pour plate), metode permukaan (surface/spread plate), metode tetes (drop plate).

(1). Metode Tuang (pour plate)

            Dari pengenceran yang dikehendaki, sebanyak 1 ml atau 0,1 ml larutan tersebut dipipet ke dalam cawan petri. Sebaiknya waktu antara dimulainya pengenceran sampai menuangkan ke dalam cawan petri tidak boleh lebih lama 30 menit. Kemudian ke cawan tersebut dimasukkan agar cair steril yang telah didinginkan sampai 50⁰C sebanyak kira-kira 15 ml. Selama penuangan medium, tutup cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar. Segera setelah penuangan, cawan petri digerakkan di atas meja secara hati-hati untuk menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakan melingkar atau gerakan seperti angka delapan. Setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut dapat diinkubasikan di dalam incubator dengan posisi terbalik.

            Inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang digunakan juga disesuaikan dengan jenis mikroba yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi, sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni yang dapat terlihat langsung oleh mata.

            Setelah akhir masa inkubasi, koloni yang terbentuk dihitung. Setiap koloni dapat dianggap berasal dari satu sel yang membelah menjadi banyak sel. Perhitungan jumlah koloni dapat menggunakan “Quebec Colony Counter”. Ketelitian akan lebih tinggi jika dilakukan pemupukan secara duplo, yaitu menggunakan dua cawan petri untuk setiap pengenceran.

(2). Metode permukaan (Surface/Pour Plate).

            Pada pemupukan dengan metode permukaan, agar steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan membeku. Setelah membeku dengan sempurna, kemudian sebanyak 0,1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut. Sebuah batang gelas melengkung (hockey stick) dicelupkan ke dalam alcohol 95% dan dipijarkan sehingga alcohol habis terbakar. Setelah dingin, batang gelas tersebut digunakan untuk meratakan contoh di atas medium agar dengan cara memutarkan cawan petri di atas meja. Selanjutnya inkubasi dilakukan seperti pada metode tuang.

Cara menghitung koloni

            Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut:

1.      Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang  mengandung jumlah koloni antara 30 dan 300

2.      Beberapa  koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni.

3.      Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni.

Contoh: penetapan jumlah mikroba pada susu. Pengenceran awal 1:10 (10^-1) dibuat dengan cara mengencerkan 1 ml susu ke dalam 9 ml larutan pengencer, dilanjutkan ke pengenceran yang lebih tinggi. Jika setelah inkubasi diperoleh 60 dan 64 koloni masing-masing pada cawan duplo pada pengenceran 10^-4, maka jumlah koloni dapat dihitung sebagai berikut (1 ml larutan dianggap mempu nyai berat 1 g).

Factor pengenceran = Pengenceran x jumlah yang ditumbuhkan.

                                = 10^-4 x 1

                                = 10^-4

Jumlah koloni    = jumlah koloni x 1/factor pengeceran

                          = (60+64)/2 x 1/10^-4

                          = 62 x 10⁴ = 6,2 x 10⁵

            Dalam SPC ditentukan cara pelaporan dan perhitungan koloni, sebagai berikut:

-          Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka yakni angka pertama (satuan) dan angka kedua (desimal), jika angka ketiga samadengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua.

-          Jika pada semua pengenceran dihasilkan kurang dari 30 koloni percawan petri, berarti pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi. Karena itu jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.

-          Jika pada semua pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, berarti pengenceran yang dilakukan terlalu rendah. Karena itu jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan factor pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung.

-          Jika jumlah cawan dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, dilaporkan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan factor pengencerannya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang dilaporkan hanya hasil yang terkecil.

-          Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan petri itu, tidak boleh dari satu. Oleh karena itu harus dipilih tingkat pengenceran yang menghasilkan kedua cawan duplo dengan koloni antara 30 dan 300.

(3). Metode tetes (Drop Plate)

            Bahan pemeriksaan yang telah dibuat homogen sebanyak 0,01 – 0,1 ml diletakkan pada medium lempeng agar yang telah dikeringkan lebih dahulu dengan menggunakan pipet 0,1 ml atau 0,2 ml posisi vertical, sehingga ujung pipet tidak menyentuh permukaan medium tetapi tetesannya menyentuh permukaan medium. Tetesan tadi dibiarkan menyebar sendiri pada permukaan medium. Biarkan pada suhu kamar sampai bagian cair terserap semua ke dalam medium agar.

            Medium lempeng agar dieramkan dengan posisi terbalik. Sesudah waktu pengeraman jumlah koloni yang tumbuh dihitung. Jumlah koloni yang diperoleh dikalikan dengan pengencerannya. Misalnya, apabila bahan yang diperiksa sebanyak 0,05 ml maka jumlah koloni adalah jumlah koloni yang diperoleh x 20 x 1/factor pengenceran.