Isolasi DNA

Read Also

Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap tanaman strawberry. Isolasi DNA ini dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan dengan mengambil beberapa bagian dagiang buah strawberry yang dihancurkan didalam tabung. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis, yaitu menggunakan larutan buffer ekstraksi.

Untuk mengisolasi jaringan buah strawberry, maka jaringan tanaman tersebut yang masih memiliki komponen-komponen lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya sel darah putih. Karena itu ke dalam tabung diberikan larutan pelisis sel yaitu buffer ekstraksi seperti yang dipaparkan di atas yang merupakan larutan hipotonis. Karena larutan tersebut hipotonis, maka akan terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan kofaktor DNAse. Selain itu dalam larutan tersebut juga terdapat larutan NaCL yang berfungsi untuk menstabilkan larutan sehingga mempercepat reaksi-raksi yang akan terjadi pada tahapan berikutnya.

Untuk melisiskan membran sel dan membran nukleus sel tanaman yang terisolasi tadi, diberikan pula larutan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) yang berfungsi untuk merusak lipid pada membran sel sehingga leukosit hancur. Pada saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB, potassium asetat, dan SDS. Senyawa CTAB dan SDS merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan mendenaturasi protein. Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas enzim nuclease. Kemudian sampel tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortekx. Setelah dihomogenkan warna larutan berubah menjadi merah.

Sampel yang telah homogen kemudian diinkubasikan, setelah itu diberi larutan Potassium asetat dan dihomogenkan, setelah homogeny sampel disimpan dalam wadah berisi es. Potassium asetat adalah senyawa yang berikatan dengan debris sel dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-potassium aesta-protein- debris sel. Setelah itu sampel disentrifuga pada kecepatan 14.000 rpm selam 10 menit.

Setelah sampel disentrifuga terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan ekstrak dan berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang berwarna merah.  Fasa atas yang kemudian diambil untuk digunkan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sel tanaman dari zat-zat lainnya.

Kemudian, pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil alcohol (24:1) yang berperan untuk mendenaturasi protein yang masih menempel pada kromosom, sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 100%. Pemberian alkohol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya. DNA dalam alcohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. Tahap tersebut merupakan terakhir, disebut juga tahap presipitasi presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon, sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Hal tersebut dapat terlihat dengan adanya benang-benang endapan DNA pada dasar tabung.

Pembahasan Elektroforesis

            Pada praktikum elektroforesis kali ini digunakan gel agarose karena dengan menggunakan gel agarose teknik yang digunakanpun cukup sederhana, mudah penanganannya dan sederhana, selain itu gel agarose mempunyai kemampuan pemisahan dengan range yang cukup luas yaitu mulai 70 pb (pasangan basa) sampai 800.000pb.

            Selainitu penggunaan gel agarose juga mempunyai keuntungan, dimana lokasi dari DNA dalam gel dapat diamati secara insitu dengan menggunakan Etidium Bromida sebagai pewarna. Etidium bromide nantinya akan berinteraksi dengan basa dari molekuk DNA dan memberikan warna orange Floresance dibawah lampu UV.

            Hasil penyinaran dibawah lampu UV dapat dilihat berupa potongan pita-pita DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen.Gambar pada hasil pengamatan kami ditemukan salah satunya potongan fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna karena pengaruh konsentrasi agarose yang menyebabkan DNA bermigrasi,sehingga fragmen-fragmennya lebih besar.