Bakteri Penambat Nitrogen Hidup Bebas
Bakteri yang hidup bebas dan mempunyai kemampuan menambat
nitrogen dari udara banyak ditemukan hampir di tiap niche ekologi tanah.
Bakteri ini biasanya berasosiasi dengan tanaman, sistem perairan, dan
sedimen (Knowles, 1982). Dalam bab ini dibahas bakteri penambat nitrogen
hidup bebas yang sudah banyak dikenal dan digunakan sebagai inokulan
seperti Azotobacter, Beijerinckia, Azospirillum, dan bakteri endofitik diazotrof
lainnya.
Konsep aerobik diazotroph adalah bakteri yang berada di sekitar
perakaran tanaman yang mampu menggunakan molekul N2 sebagai sumber
nitrogen untuk pertumbuhannya. Pada umumnya bakteri ini mempunyai
mekanisme untuk melindungi enzim dari pengaruh oksigen meskipun bakteri
ini sendiri memerlukan oksigen untuk respirasi dan pembentukan ATP.
Mekanisme ini dikenal dengan istilah perlindungan respirasi (respiratory
protection). Untuk mengatasi permasalahan oksigen, beberapa bakteri
mempunyai ciri khusus seperti Azospirillum yang termasuk aerobik diazotrof,
bersifat mikroaerofilik yaitu menambat nitrogen pada kondisi tekanan oksigen
sangat rendah (0,007 atm atau 0,7 KPa) (Okon et al., 1977a) dan sistem
perlindungan respirasi pada Azotobacter memerlukan banyak substrat karbon
untuk memenuhi kebutuhan oksigen dan pertumbuhannya. Beberapa spesies
Azotobacter menghasilkan protein untuk mengikat nitrogenase dan
melindunginya dari kerusakan oleh oksigen. Selain itu, beberapa bakteri
aerobik diazotrof menghasilkan koloni besar dan gummy (ekstraselular
polisakarida) pada media agar bebas nitrogen yang berfungsi sebagai
penghalang (barrier), sehingga bagian dalam koloni terbebas dari oksigen.
2.3.1 Isolasi dan Identifikasi Azotobacter
(Krieg & Dobereiner, 1984)
Prinsip
Azotobacter spp. dapat mengikat N2 dari udara secara bebas. Bakteri
ini sangat sensitif terhadap pH rendah sehingga pada pH<6 Azotobacter
jarang dijumpai. Biakan Azotobacter spp. dapat berkembang dan
membentuk koloni pada cawan agar yang diinkubasi dalam suhu ruang.
Bakteri ini mempunyai kemampuan tumbuh dalam substrat yang banyak
mengandung karbohidrat dan tidak mengandung nitrogen, sedangkan
bakteri heterotrofik yang lain tidak tumbuh dalam kondisi ini karena tidak
mempunyai kemampuan mengikat N2 dari udara. Sifat ini memudahkan
untuk isolasi Azotobacter. Koloni Azotobacter berkembang cukup cepat dan
mempunyai ciri khusus yang memungkinkan untuk dikenali. Secara visual
Azotobacter dapat dikenal dengan ciri-ciri: koloni kecil dan banyak,
mengkilap, biasanya mempunyai permukaan yang datar dengan sedikit
cekung di bagian tengah, seperti susu dan kelihatan bening. Warna koloni
sangat tergantung pada spesies, misalnya A.chroococcum biasanya
menghasilkan pigmen coklat atau hitam.
Alat dan bahan
- Cawan Petri
- Tabung reaksi
- Lup inokulasi
- Labu Erlenmeyer
- Pengaduk gelas
- Lampu spiritus
- Vortex
- Mesin pengocok
- Inkubator
- Autoklaf
- Alkohol
- Larutan garam fisiologis (NaCl 0,85 %) untuk seri pengenceran
Prosedur
- Masukkan 10 g contoh tanah ke dalam 90 ml larutan garam fisiologis
steril, kemudian buat seri pengenceran dari 10-1 hingga 10-7.
- Inokulasi tiap seri pengenceran ke dalam medium seleksi Azotobacter,
dan inkubasi pada suhu 30oC.
- Koloni Azotobacter chroococcum tampak setelah 24 jam inkubasi
dengan ciri putih basah dan berubah menjadi coklat gelap setelah 3-5
hari. Ciri koloni Azotobacter vinelandii dan Azomonas sama, hanya
tidak berubah gelap. Sedangkan koloni Azotobacter paspali, setelah
inkubasi 48 jam, pusat koloni menjadi kuning yang disebabkan asimilasi
bromtimol biru dan pengasaman medium.
2.3.2 Isolasi dan Identifikasi Azospirillum
(Okon et al., 1977b; Reinhold et al., 1987; Khammas et al., 1989;
Dobereiner, 1992)
Prinsip
Ada lima species Azospirillum yang mempunyai sifat fisiologis
berbeda, yaitu A. brasilense, A. liporerum, A. amazonense, A. irakense dan
A. balopraeferans. Untuk mengisolasinya digunakan medium semi-padat
bebas nitrogen karena bakteri ini mempunyai karakteristik aerotaktik, yaitu
berpindah dari suatu tempat di dalam medium untuk mencari keseimbangan
difusi oksigen. Bakteri ini membentuk pelikel yang terletak 5 mm dari
permukaan media yang kemudian akan berpindah ke permukaan ketika
nitrogen di dalam sel sudah terakumulasi.
Prosedur
- Masukkan 10 g contoh tanah ke dalam 90 ml larutan garam fisiologis
steril, kemudian kocok dan buat seri pengenceran 10-1 hingga 10-7.
- Inokulasi serial pengenceran ke dalam medium seleksi Nfb semi-padat
(sebanyak lima ulangan per seri pengenceran), dan inkubasi selama 3 -
5 hari hingga terbentuk pelikel berbentuk cincin berwarna putih (berarti
positif) dan yang tidak membentuk pelikel (berarti negatif).
- Amati pertumbuhannya, isolasi pelikel dan gores pada media agar yang
sama tetapi diberi agar 15 g L-1 dan tambahkan 0,02 yeast extract.
Kemudian inkubasi selama 6 - 7 hari.
- Apabila sudah ada koloni tunggal (kecil, putih agak kering dan keriting),
pindahkan satu koloni ke media semi-padat nitrogen bebas yang baru
dan murnikan dengan menggoreskannya pada medium kentang.
- Setelah inkubasi, koloni kecil, keriting dan kering akan muncul dan
berubah agak merah muda setelah 1 minggu. Kemudian pindahkan ke
semi-padat NfB dalam botol kecil untuk identifikasi di bawah mikroskop
(in wet mounts).
Sel A.brasilense bersifat sangat motil, kurva batang dengan
perpindahan spirilloid. Sedangkan pada sel A. lipoferum biasanya warna
medium berubah dari warna semula kuning menjadi biru (alkalin), dan
berubah menjadi bentuk pleomorfik.
Menurut Khamnas et al. (1989), A irakense dapat diisolasi dengan
cara yang sama, kecuali inkubasi dilakkan pada suhu 30oC.
Azospirillum halopraeferans (Reinhold et al., 1987) diisolasi pada
medium basa tetapi dengan modifikasi: atur pH menjadi 8,5; tambahkan
1,2% NaCl, dan inkubasi cawan Petri pada suhu 41oC.
A. amazonense bagus diisolasi pada medium sukrosa semi-padat.
Setelah inkubasi selama 3-5 hari pada suhu 35oC akan terbentuk pelikel,
kemudian goreskan pelikel di atas medium LGI yang mengandung 0,02 g
ekstrak khamir. Bentuk sel biasanya kecil, putih, koloni keriting, hampir
sama dengan Azospirillum spp. yang lainnya. Ini terbentuk setelah 5 hari
inkubasi dan cek lagi di medium semi-padat LGI untuk ketergantungan
nitrogen tanpa produksi asam (medium berwarna hijau). Pemurnian
dilakukan dengan menggoreskannya pada medium agar kentang yang
mengandung sukrosa dan malat. Pada medium ini, koloni A. amazonense
berwarna putih dan menjadi besar (5 mm) dengan permukaan tepi yang
timbul. Bentuk koloni sangat berbeda dari Azospirillum spp. yang lainnya.
Azospirillum spp merupakan bakteri tanah, tetapi beberapa di
antaranya banyak terdapat di rhizosfir dan ada strain tertentu yang mampu
menginfeksi akar atau batang pada berbagai tanaman (Dobereiner, 1992).
Ulasan
Bila Azospirillum dibiakkan di dalam media cair, maka pH media
harus diperhatikan. Media malat mempunyai pH awal 7,0. Sama halnya
dengan bakteri lain, Azospirillum memerlukan selang pH yang tertentu
untuk pertumbuhannya.
Kenaikan pH media Azospirillum disebabkan bakteri ini mengikat N2
dari udara dan membentuk NH4
+ atau dalam bentuk senyawa N lainnya dan
membebaskannya ke dalam media. Pada permulaan, peningkatan pH tidak
terlalu tinggi tetapi setelah beberapa hari pH meningkat lebih dari 1,0 unit.
Hal ini perlu diperhatikan dalam membiakkan Azospirillum karena
pertumbuhan akan terhalang akibat tingginya pH media. Sebaiknya media
dijaga agar tetap 7,0 dengan penambahan 0,01 M H2SO4.
2.3.3 Isolasi dan Identifikasi Herbaspirillum dan Acetobacter
(Calvalcante & Dobereiner, 1988; Gillis et al., 1989; Dobereiner, 1992;
Reinhold-Hurek et al., 1993)
Prinsip
Herbaspirillum spp., Azoarcus spp., dan Acetobacter diazotrophicus
adalah obligat tanaman endofit atau hanya dapat diisolasi dari tanaman
inang. Baru-baru ini ditemukan bahwa bakteri ini lebih banyak ke arah
efisiensi penambatan nitrogen yang menghasilkan pertumbuhan tanaman
yang lebih baik, khususnya di daerah tropik. H. seropedicae banyak
dijumpai di rizosfir tanaman rumput-rumputan. H. rubrisubalbicans sampai
saat ini diketahui sebagai Pseudomonas rubrisubalbicans (Gillis et al., 1991;
Pimentel et al., 1991), yakni patogen pada tanaman tebu yang
menyebabkan penyakit mottled stripe pada varietas tebu yang sensitif.
Sedangkan Azoarcus diisolasi dari rumput Kallar (Leptochloa fusca) di
Pakistan (Reinhold-Hurek et al., 1993).
Alat
- Inkubator 30-35oC
- Mikroskop
- Alat gelas steril
- Cawan Petri
Bahan
- Medium semi-padat JNFb untuk mengisolasi Herbaspirillum spp., H.
seropedicae dan H. rubrisubalbicans.
D,L-asam malat 5 g
K2HPO4 1,5 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
NaCl2.2H2O 0,02 g
Larutan mikro mikro (seperti di atas) 2 ml
Vitamin (seperti di atas) 1 ml
Larutan FeEDTA 1,64% 4 ml
Larutan bromtimol biru (0,5% dalam 0,2M KOH) 2 ml
Agar 2 g
􀂃 Larutkan dalam 800 ml akuades, utur pH menjadi 6, dan
tambahkan akuades sampai 1.000 ml. Pelarutan bahan
dilakukan secara bertahap.
Prosedur
Herbaspirillum seropedicae dapat diisolasi dari sampel akar, batang
dan daun pada semua jenis tanaman rumput-rumputan, sedangkan H.
rubrisubalbicans diisolasi dari tanaman tebu dengan menggunakan media
semi padat JNFb, biasanya diperoleh dari pengenceran 10-2 - 10-6.
Pertumbuhan Herbaspirillum spp. dalam medium ditunjukkan oleh adanya
pelikel yang mirip Azospirillum spp. Di bawah mikroskop fase kontras (wet
mounts) bentuk selnya lebih kecil (0,6 – 0,7 x 3-5 μm), berbentuk kurva dan
hanya terlihat perpindahan yang spiraloid ketika dekat dengan gelembung
udara. Kedua jenis bakteri ini mempunyai sifat morfologi sangat sama dan
hanya dapat dibedakan apabila kedua bakteri ini ditumbuhkan dalam
sumber karbon dengan kombinasi nitrogen meso-erythritol yang pada
Herbaspirillum seropedicae negatif sedangkan H. rubrisubalbicans positif
atau menggunakan sekuensing 23S rRNA. Isolasi Herbaspirillum spp.
dilakukan pada cawan Petri yang berisi media agar NFb dengan 0,02 g sari
khamir dan 4 ml bromtimol biru. Pada awal inkubasi bentuk koloni kecil,
basah, dan berwarna putih, tetapi setelah diinkubasi selama 1 minggu
bagian tengah koloni akan berubah menjadi biru gelap. Pemurnian
dilakukan pada media agar kentang dengan sukrosa dan malat. Setelah
inkubasi bentuk koloni kecil, basah, timbul dan bagian tengah koloni
menjadi coklat.
Untuk Azoarcus spp., pertumbuhan pada medium semi-padat NFb
sama dengan Herbaspirillum spp. Koloni bakteri ini di atas medium NFb
agar berbentuk non-difusible berwarna kekuningan yang akan lebih terlihat
apabila sumber karbonnya etanol. Sel Azoarcus terjadi satu koloni atau
berpasangan, dengan ukuran lebar 0,4 – 1,0 μm, panjang 1,1 - 4 μm dan
berbentuk mirip huruf S (Reinhold-Hurek et al., 1993).
Acetobacter diazotrophicus dapat diisolasi dengan medium semipadat
LGIP dengan komposisi medium sama seperti medium LGI, tetapi
sumber karbon adalah sukrosa atau gula tebu dengan konsentrasi 100 g L-1
dan konsentrasi agar ditingkatkan menjadi 2 g. Pengaturan pH 5,5
dilakukan dengan penambahan asam asetat. Dalam medium ini, 4 - 6 hari
setelah inokulasi (pada 0,1 ml batang atau daun tebu yang sudah digiling),
akan muncul pelikel bawah-permukaan (subsurface) yang kemudian pindah
ke permukaan dengan warna menjadi oranye gelap, sedangkan medium di
bawahnya menjadi tidak berwarna yang disebabkan asimilasi bromtimol biru
oleh bakteri. Kemudian dimurnikan pada medium yang sama di cawan Petri
(dengan 20 g agar L-1). Setelah inkubasi selam 1 minggu, muncul koloni
kecil berwarna oranye gelap dan basah. Koloni ini mudah dikenali dan
dimurnikan pada medium agar kentang yang mengandung 10% gula tebu
(tidak menggunakan malat). Pada medium kentang, koloni akan terbentuk
setelah 1 minggu inkubasi dengan warna coklat gelap dan lembap.
Ulasan
Acetobacter diazotrophicus hanya dapat diisolasi dari tanaman tebu,
ubi jalar dan rumput Kamerun atau semua jenis tanaman yang kaya gula
yang diperbanyak secara vegetatif. Hal ini berarti bahwa bakteri obligat
endofitik dapat di-transmitted dalam batang yang terpotong dari tanaman.
Bakteri ini tidak dapat diisolasi dari tanah ataupun tanaman lain (Calvante &
Dobereiner, 1988; Gillis et al., 1989).
nitrogen dari udara banyak ditemukan hampir di tiap niche ekologi tanah.
Bakteri ini biasanya berasosiasi dengan tanaman, sistem perairan, dan
sedimen (Knowles, 1982). Dalam bab ini dibahas bakteri penambat nitrogen
hidup bebas yang sudah banyak dikenal dan digunakan sebagai inokulan
seperti Azotobacter, Beijerinckia, Azospirillum, dan bakteri endofitik diazotrof
lainnya.
Konsep aerobik diazotroph adalah bakteri yang berada di sekitar
perakaran tanaman yang mampu menggunakan molekul N2 sebagai sumber
nitrogen untuk pertumbuhannya. Pada umumnya bakteri ini mempunyai
mekanisme untuk melindungi enzim dari pengaruh oksigen meskipun bakteri
ini sendiri memerlukan oksigen untuk respirasi dan pembentukan ATP.
Mekanisme ini dikenal dengan istilah perlindungan respirasi (respiratory
protection). Untuk mengatasi permasalahan oksigen, beberapa bakteri
mempunyai ciri khusus seperti Azospirillum yang termasuk aerobik diazotrof,
bersifat mikroaerofilik yaitu menambat nitrogen pada kondisi tekanan oksigen
sangat rendah (0,007 atm atau 0,7 KPa) (Okon et al., 1977a) dan sistem
perlindungan respirasi pada Azotobacter memerlukan banyak substrat karbon
untuk memenuhi kebutuhan oksigen dan pertumbuhannya. Beberapa spesies
Azotobacter menghasilkan protein untuk mengikat nitrogenase dan
melindunginya dari kerusakan oleh oksigen. Selain itu, beberapa bakteri
aerobik diazotrof menghasilkan koloni besar dan gummy (ekstraselular
polisakarida) pada media agar bebas nitrogen yang berfungsi sebagai
penghalang (barrier), sehingga bagian dalam koloni terbebas dari oksigen.
2.3.1 Isolasi dan Identifikasi Azotobacter
(Krieg & Dobereiner, 1984)
Prinsip
Azotobacter spp. dapat mengikat N2 dari udara secara bebas. Bakteri
ini sangat sensitif terhadap pH rendah sehingga pada pH<6 Azotobacter
jarang dijumpai. Biakan Azotobacter spp. dapat berkembang dan
membentuk koloni pada cawan agar yang diinkubasi dalam suhu ruang.
Bakteri ini mempunyai kemampuan tumbuh dalam substrat yang banyak
mengandung karbohidrat dan tidak mengandung nitrogen, sedangkan
bakteri heterotrofik yang lain tidak tumbuh dalam kondisi ini karena tidak
mempunyai kemampuan mengikat N2 dari udara. Sifat ini memudahkan
untuk isolasi Azotobacter. Koloni Azotobacter berkembang cukup cepat dan
mempunyai ciri khusus yang memungkinkan untuk dikenali. Secara visual
Azotobacter dapat dikenal dengan ciri-ciri: koloni kecil dan banyak,
mengkilap, biasanya mempunyai permukaan yang datar dengan sedikit
cekung di bagian tengah, seperti susu dan kelihatan bening. Warna koloni
sangat tergantung pada spesies, misalnya A.chroococcum biasanya
menghasilkan pigmen coklat atau hitam.
Alat dan bahan
- Cawan Petri
- Tabung reaksi
- Lup inokulasi
- Labu Erlenmeyer
- Pengaduk gelas
- Lampu spiritus
- Vortex
- Mesin pengocok
- Inkubator
- Autoklaf
- Alkohol
- Larutan garam fisiologis (NaCl 0,85 %) untuk seri pengenceran
Media
- Media seleksi Azotobacter (LG medium):
􀂃 Timbang sukrosa 20 g; K2HPO4 0,05 g; KH2PO4 0,15 g; CaCL2
0,01 g; MgSO4.7H2O 0,20 g; Na2MoO4.2H2O 2 mg; FeCl2 0,01 g;
bromtimol biru (0,5% larutan dalam etanol) 2 ml; CaCO3 1 g;
agar 15 g dan akuades 1.000 ml.
􀂃 Timbang sukrosa 20 g; K2HPO4 0,05 g; KH2PO4 0,15 g; CaCL2
0,01 g; MgSO4.7H2O 0,20 g; Na2MoO4.2H2O 2 mg; FeCl2 0,01 g;
bromtimol biru (0,5% larutan dalam etanol) 2 ml; CaCO3 1 g;
agar 15 g dan akuades 1.000 ml.
Prosedur
- Masukkan 10 g contoh tanah ke dalam 90 ml larutan garam fisiologis
steril, kemudian buat seri pengenceran dari 10-1 hingga 10-7.
- Inokulasi tiap seri pengenceran ke dalam medium seleksi Azotobacter,
dan inkubasi pada suhu 30oC.
- Koloni Azotobacter chroococcum tampak setelah 24 jam inkubasi
dengan ciri putih basah dan berubah menjadi coklat gelap setelah 3-5
hari. Ciri koloni Azotobacter vinelandii dan Azomonas sama, hanya
tidak berubah gelap. Sedangkan koloni Azotobacter paspali, setelah
inkubasi 48 jam, pusat koloni menjadi kuning yang disebabkan asimilasi
bromtimol biru dan pengasaman medium.
2.3.2 Isolasi dan Identifikasi Azospirillum
(Okon et al., 1977b; Reinhold et al., 1987; Khammas et al., 1989;
Dobereiner, 1992)
Prinsip
Ada lima species Azospirillum yang mempunyai sifat fisiologis
berbeda, yaitu A. brasilense, A. liporerum, A. amazonense, A. irakense dan
A. balopraeferans. Untuk mengisolasinya digunakan medium semi-padat
bebas nitrogen karena bakteri ini mempunyai karakteristik aerotaktik, yaitu
berpindah dari suatu tempat di dalam medium untuk mencari keseimbangan
difusi oksigen. Bakteri ini membentuk pelikel yang terletak 5 mm dari
permukaan media yang kemudian akan berpindah ke permukaan ketika
nitrogen di dalam sel sudah terakumulasi.
Alat dan bahan
Media dan larutan
- Medium Nfb semi-padat:
􀂃 Timbang 5 g asam malat; 0,5 g K2HPO4; 0,2 gr MgSO4. 7H2O;
0,1 g NaCl; 0,02 g CaCl2.2H2O; 2 ml larutan unsur mikro; 2 ml
bromtimol biru (0,5% larutan dalam 0,2 M KOH); larutan
FeEDTA 1,64%; 1 ml larutan vitamin; dan 1,75 g agar. Semua
bahan dilarutkan dalam 800 ml akuades. Atur pH menjadi 6,8
dengan KOH dan tambahkan akuades sampai volume media
1.000 ml
- Larutan unsur mikro
􀂃 Timbang 0,4 g CuSO4.5H2O; 0,12 g ZnSO4.7H2O; 1,40 g H2BO4;
1 g Na2MoO4.2H2O; dan 1,5 g MnSO4.H2O. Larutkan dalam 800
ml akuades, kemudian tambahkan akuades sampai volume
media 1.000 ml
- Larutan vitamin
􀂃 Timbang 10 mg biotin; 20 mg pyridoxol-HCl; akuades 100 ml.
Larutan ini jangan diautoklaf.
- Medium kentang
􀂃 Timbang 200 g kentang segar, kupas dan masak selama 30
menit dalam 1.000 ml akuades, kemudian saring dengan kain.
Tambahkan 2,5 g asam malat; 2,5 g sukrosa; 15 g agar. Atur pH
menjadi 6,8.
- Medium semi-padat untuk isolasi A. amazonese (medium LGI)
􀂃 Timbang 0,2 g K2HPO4; 0,6 g KH2PO4; 0,002 g CaCl2.2H2O; 0,2
g MgSO4.7H2O; 0,002 g Na2MoO4.2H2O; 0,01 g FeCl2; bromotimol
biru (larutan 0,5% dalam KOH 0,2M); 5 g sukrosa; dan 1,8
g agar. Larutkan dalam 800 ml akuades, atur pH menjadi 6,0
dan tambahkan akuades sampai 1.000 ml.
Media dan larutan
- Medium Nfb semi-padat:
􀂃 Timbang 5 g asam malat; 0,5 g K2HPO4; 0,2 gr MgSO4. 7H2O;
0,1 g NaCl; 0,02 g CaCl2.2H2O; 2 ml larutan unsur mikro; 2 ml
bromtimol biru (0,5% larutan dalam 0,2 M KOH); larutan
FeEDTA 1,64%; 1 ml larutan vitamin; dan 1,75 g agar. Semua
bahan dilarutkan dalam 800 ml akuades. Atur pH menjadi 6,8
dengan KOH dan tambahkan akuades sampai volume media
1.000 ml
- Larutan unsur mikro
􀂃 Timbang 0,4 g CuSO4.5H2O; 0,12 g ZnSO4.7H2O; 1,40 g H2BO4;
1 g Na2MoO4.2H2O; dan 1,5 g MnSO4.H2O. Larutkan dalam 800
ml akuades, kemudian tambahkan akuades sampai volume
media 1.000 ml
- Larutan vitamin
􀂃 Timbang 10 mg biotin; 20 mg pyridoxol-HCl; akuades 100 ml.
Larutan ini jangan diautoklaf.
- Medium kentang
􀂃 Timbang 200 g kentang segar, kupas dan masak selama 30
menit dalam 1.000 ml akuades, kemudian saring dengan kain.
Tambahkan 2,5 g asam malat; 2,5 g sukrosa; 15 g agar. Atur pH
menjadi 6,8.
- Medium semi-padat untuk isolasi A. amazonese (medium LGI)
􀂃 Timbang 0,2 g K2HPO4; 0,6 g KH2PO4; 0,002 g CaCl2.2H2O; 0,2
g MgSO4.7H2O; 0,002 g Na2MoO4.2H2O; 0,01 g FeCl2; bromotimol
biru (larutan 0,5% dalam KOH 0,2M); 5 g sukrosa; dan 1,8
g agar. Larutkan dalam 800 ml akuades, atur pH menjadi 6,0
dan tambahkan akuades sampai 1.000 ml.
Prosedur
- Masukkan 10 g contoh tanah ke dalam 90 ml larutan garam fisiologis
steril, kemudian kocok dan buat seri pengenceran 10-1 hingga 10-7.
- Inokulasi serial pengenceran ke dalam medium seleksi Nfb semi-padat
(sebanyak lima ulangan per seri pengenceran), dan inkubasi selama 3 -
5 hari hingga terbentuk pelikel berbentuk cincin berwarna putih (berarti
positif) dan yang tidak membentuk pelikel (berarti negatif).
- Amati pertumbuhannya, isolasi pelikel dan gores pada media agar yang
sama tetapi diberi agar 15 g L-1 dan tambahkan 0,02 yeast extract.
Kemudian inkubasi selama 6 - 7 hari.
- Apabila sudah ada koloni tunggal (kecil, putih agak kering dan keriting),
pindahkan satu koloni ke media semi-padat nitrogen bebas yang baru
dan murnikan dengan menggoreskannya pada medium kentang.
- Setelah inkubasi, koloni kecil, keriting dan kering akan muncul dan
berubah agak merah muda setelah 1 minggu. Kemudian pindahkan ke
semi-padat NfB dalam botol kecil untuk identifikasi di bawah mikroskop
(in wet mounts).
Sel A.brasilense bersifat sangat motil, kurva batang dengan
perpindahan spirilloid. Sedangkan pada sel A. lipoferum biasanya warna
medium berubah dari warna semula kuning menjadi biru (alkalin), dan
berubah menjadi bentuk pleomorfik.
Menurut Khamnas et al. (1989), A irakense dapat diisolasi dengan
cara yang sama, kecuali inkubasi dilakkan pada suhu 30oC.
Azospirillum halopraeferans (Reinhold et al., 1987) diisolasi pada
medium basa tetapi dengan modifikasi: atur pH menjadi 8,5; tambahkan
1,2% NaCl, dan inkubasi cawan Petri pada suhu 41oC.
A. amazonense bagus diisolasi pada medium sukrosa semi-padat.
Setelah inkubasi selama 3-5 hari pada suhu 35oC akan terbentuk pelikel,
kemudian goreskan pelikel di atas medium LGI yang mengandung 0,02 g
ekstrak khamir. Bentuk sel biasanya kecil, putih, koloni keriting, hampir
sama dengan Azospirillum spp. yang lainnya. Ini terbentuk setelah 5 hari
inkubasi dan cek lagi di medium semi-padat LGI untuk ketergantungan
nitrogen tanpa produksi asam (medium berwarna hijau). Pemurnian
dilakukan dengan menggoreskannya pada medium agar kentang yang
mengandung sukrosa dan malat. Pada medium ini, koloni A. amazonense
berwarna putih dan menjadi besar (5 mm) dengan permukaan tepi yang
timbul. Bentuk koloni sangat berbeda dari Azospirillum spp. yang lainnya.
Azospirillum spp merupakan bakteri tanah, tetapi beberapa di
antaranya banyak terdapat di rhizosfir dan ada strain tertentu yang mampu
menginfeksi akar atau batang pada berbagai tanaman (Dobereiner, 1992).
Ulasan
Bila Azospirillum dibiakkan di dalam media cair, maka pH media
harus diperhatikan. Media malat mempunyai pH awal 7,0. Sama halnya
dengan bakteri lain, Azospirillum memerlukan selang pH yang tertentu
untuk pertumbuhannya.
Kenaikan pH media Azospirillum disebabkan bakteri ini mengikat N2
dari udara dan membentuk NH4
+ atau dalam bentuk senyawa N lainnya dan
membebaskannya ke dalam media. Pada permulaan, peningkatan pH tidak
terlalu tinggi tetapi setelah beberapa hari pH meningkat lebih dari 1,0 unit.
Hal ini perlu diperhatikan dalam membiakkan Azospirillum karena
pertumbuhan akan terhalang akibat tingginya pH media. Sebaiknya media
dijaga agar tetap 7,0 dengan penambahan 0,01 M H2SO4.
2.3.3 Isolasi dan Identifikasi Herbaspirillum dan Acetobacter
(Calvalcante & Dobereiner, 1988; Gillis et al., 1989; Dobereiner, 1992;
Reinhold-Hurek et al., 1993)
Prinsip
Herbaspirillum spp., Azoarcus spp., dan Acetobacter diazotrophicus
adalah obligat tanaman endofit atau hanya dapat diisolasi dari tanaman
inang. Baru-baru ini ditemukan bahwa bakteri ini lebih banyak ke arah
efisiensi penambatan nitrogen yang menghasilkan pertumbuhan tanaman
yang lebih baik, khususnya di daerah tropik. H. seropedicae banyak
dijumpai di rizosfir tanaman rumput-rumputan. H. rubrisubalbicans sampai
saat ini diketahui sebagai Pseudomonas rubrisubalbicans (Gillis et al., 1991;
Pimentel et al., 1991), yakni patogen pada tanaman tebu yang
menyebabkan penyakit mottled stripe pada varietas tebu yang sensitif.
Sedangkan Azoarcus diisolasi dari rumput Kallar (Leptochloa fusca) di
Pakistan (Reinhold-Hurek et al., 1993).
Alat
- Inkubator 30-35oC
- Mikroskop
- Alat gelas steril
- Cawan Petri
Bahan
- Medium semi-padat JNFb untuk mengisolasi Herbaspirillum spp., H.
seropedicae dan H. rubrisubalbicans.
D,L-asam malat 5 g
K2HPO4 1,5 g
MgSO4.7H2O 0,2 g
NaCl2.2H2O 0,02 g
Larutan mikro mikro (seperti di atas) 2 ml
Vitamin (seperti di atas) 1 ml
Larutan FeEDTA 1,64% 4 ml
Larutan bromtimol biru (0,5% dalam 0,2M KOH) 2 ml
Agar 2 g
􀂃 Larutkan dalam 800 ml akuades, utur pH menjadi 6, dan
tambahkan akuades sampai 1.000 ml. Pelarutan bahan
dilakukan secara bertahap.
Prosedur
Herbaspirillum seropedicae dapat diisolasi dari sampel akar, batang
dan daun pada semua jenis tanaman rumput-rumputan, sedangkan H.
rubrisubalbicans diisolasi dari tanaman tebu dengan menggunakan media
semi padat JNFb, biasanya diperoleh dari pengenceran 10-2 - 10-6.
Pertumbuhan Herbaspirillum spp. dalam medium ditunjukkan oleh adanya
pelikel yang mirip Azospirillum spp. Di bawah mikroskop fase kontras (wet
mounts) bentuk selnya lebih kecil (0,6 – 0,7 x 3-5 μm), berbentuk kurva dan
hanya terlihat perpindahan yang spiraloid ketika dekat dengan gelembung
udara. Kedua jenis bakteri ini mempunyai sifat morfologi sangat sama dan
hanya dapat dibedakan apabila kedua bakteri ini ditumbuhkan dalam
sumber karbon dengan kombinasi nitrogen meso-erythritol yang pada
Herbaspirillum seropedicae negatif sedangkan H. rubrisubalbicans positif
atau menggunakan sekuensing 23S rRNA. Isolasi Herbaspirillum spp.
dilakukan pada cawan Petri yang berisi media agar NFb dengan 0,02 g sari
khamir dan 4 ml bromtimol biru. Pada awal inkubasi bentuk koloni kecil,
basah, dan berwarna putih, tetapi setelah diinkubasi selama 1 minggu
bagian tengah koloni akan berubah menjadi biru gelap. Pemurnian
dilakukan pada media agar kentang dengan sukrosa dan malat. Setelah
inkubasi bentuk koloni kecil, basah, timbul dan bagian tengah koloni
menjadi coklat.
Untuk Azoarcus spp., pertumbuhan pada medium semi-padat NFb
sama dengan Herbaspirillum spp. Koloni bakteri ini di atas medium NFb
agar berbentuk non-difusible berwarna kekuningan yang akan lebih terlihat
apabila sumber karbonnya etanol. Sel Azoarcus terjadi satu koloni atau
berpasangan, dengan ukuran lebar 0,4 – 1,0 μm, panjang 1,1 - 4 μm dan
berbentuk mirip huruf S (Reinhold-Hurek et al., 1993).
Acetobacter diazotrophicus dapat diisolasi dengan medium semipadat
LGIP dengan komposisi medium sama seperti medium LGI, tetapi
sumber karbon adalah sukrosa atau gula tebu dengan konsentrasi 100 g L-1
dan konsentrasi agar ditingkatkan menjadi 2 g. Pengaturan pH 5,5
dilakukan dengan penambahan asam asetat. Dalam medium ini, 4 - 6 hari
setelah inokulasi (pada 0,1 ml batang atau daun tebu yang sudah digiling),
akan muncul pelikel bawah-permukaan (subsurface) yang kemudian pindah
ke permukaan dengan warna menjadi oranye gelap, sedangkan medium di
bawahnya menjadi tidak berwarna yang disebabkan asimilasi bromtimol biru
oleh bakteri. Kemudian dimurnikan pada medium yang sama di cawan Petri
(dengan 20 g agar L-1). Setelah inkubasi selam 1 minggu, muncul koloni
kecil berwarna oranye gelap dan basah. Koloni ini mudah dikenali dan
dimurnikan pada medium agar kentang yang mengandung 10% gula tebu
(tidak menggunakan malat). Pada medium kentang, koloni akan terbentuk
setelah 1 minggu inkubasi dengan warna coklat gelap dan lembap.
Ulasan
Acetobacter diazotrophicus hanya dapat diisolasi dari tanaman tebu,
ubi jalar dan rumput Kamerun atau semua jenis tanaman yang kaya gula
yang diperbanyak secara vegetatif. Hal ini berarti bahwa bakteri obligat
endofitik dapat di-transmitted dalam batang yang terpotong dari tanaman.
Bakteri ini tidak dapat diisolasi dari tanah ataupun tanaman lain (Calvante &
Dobereiner, 1988; Gillis et al., 1989).
No comments