ELEKTROFORESIS PADA GEL AGAROSE
Elektroforesi gel adalah salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik
ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik.
Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju
perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan
tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel
biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai
teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam
metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting
yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked)
yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein
atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang
digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi
berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker),
menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk
memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa),
gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah
dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)
pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan
kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel
ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam
nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh
muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga
agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu
panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk
menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi
dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining)
agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak,
atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan
untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet
(misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di
bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram
gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada
gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan
sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel
pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel
selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa
molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker)
yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan
untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis
marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada
lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan
ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma
ukuran molekul.
DNA dapat
ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose atau gel
poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis.
Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan
ethidium bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.
DNA merupakan
molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan listrik, DNA akan
bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan kecepatannya
tergantung dari :
a.
Ukuran
molekul DNA
b.
Kerapatan
media gel yang dilalui DNA
c.
Arus
listrik yang diberikan
Sebelum
dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga muatan perwarna loading buffer (dye), yang
berfungsi untuk :
1.
Menambah
densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur
2.
Perwarna
untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur.
3.
Dapat
bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan
No comments