Kultivasi Virus - Tujuan dan Metode

Read Also

• Virus adalah parasit intraseluler obligat sehingga mereka bergantung pada host untuk kelangsungan hidupnya.

• Mereka tidak dapat ditumbuhkan di media kultur tak hidup atau di piring agar saja, mereka harus membutuhkan sel hidup untuk mendukung replikasi mereka.

• Tujuan utama dari kultur virus adalah:

• Untuk mengisolasi dan mengidentifikasi virus dalam sampel klinis. Demonstrasi virus dalam spesimen klinis yang sesuai dengan kultur menetapkan diagnosis penyakit virus.

• Melakukan penelitian tentang struktur virus, replikasi, genetika dan pengaruhnya terhadap sel host.

• Untuk mempersiapkan virus untuk produksi vaksin.

• Isolasi virus selalu dianggap sebagai standar emas untuk menetapkan etiologi virus suatu penyakit.

• Sebagian besar virus dapat dibudidayakan di Hewan percobaan, Telur berembrio atau Kultur jaringan.

Spesimen untuk Kultur Virus

Pengumpulan spesimen klinis yang tepat tergantung pada jenis penyakit virus. Misalnya, cerebrospinal fluid (CSF) adalah spesimen pilihan untuk diagnosis infeksi virus central nervous system (CNS) yang disebabkan oleh arbovirus, picornavirus, atau virus rabies.

Inokulasi Hewan

• Tikus paling sering digunakan untuk isolasi virus dengan inokulasi hewan.

• Selain itu, kelinci, hamster, hewan pengerat yang baru lahir atau menyusui juga digunakan.

• Hewan percobaan jarang digunakan untuk budidaya virus tetapi memainkan peran penting dalam studi patogenesis infeksi virus dan onkogenesis virus.

• Rute intraserebral, subkutan, intraperitoneal, atau intranasal adalah berbagai rute inokulasi.

• Setelah inokulasi, hewan diamati untuk tanda-tanda penyakit atau kematian.

• Hewan yang terinfeksi kemudian dikorbankan dan jaringan yang terinfeksi diperiksa untuk keberadaan virus dengan berbagai tes, dan juga untuk badan inklusi dalam jaringan yang terinfeksi.

• Selanjutnya, mencit bayi (menyusui) digunakan untuk isolasi virus coxsackie dan virus rabies.

Telur Berembrio

• Telur ayam berembrio pertama kali digunakan untuk budidaya virus oleh Goodpasture pada tahun 1931.

• Metode yang dikembangkan lebih lanjut oleh Burnet digunakan untuk budidaya virus di lokasi berbeda dari telur berembrio.

• Biasanya, telur ayam berumur 8-11 hari digunakan untuk kultur virus.

• Virus diisolasi di tempat yang berbeda dari telur, seperti kantung kuning telur, amniotic cavity, allantoic cavity, dan chorioallantoic membrane (CAM).

• Banyak dari virus ini menyebabkan fokus yang jelas dan khas, menyediakan metode untuk identifikasi, kuantifikasi, atau penilaian patogenisitas virus.

• Telur berembrio juga digunakan untuk menumbuhkan stok titer yang lebih tinggi dari beberapa virus di laboratorium penelitian dan untuk produksi vaksin.

• Kantung kuning telur: Inokulasi kantung kuning telur digunakan untuk budidaya ensefalitis Jepang, ensefalitis Saint Louis, dan virus West Nile. Ini juga digunakan untuk pertumbuhan klamidia dan riketsia.

• Amniotic cavity: Inokulasi di rongga ketuban digunakan terutama untuk isolasi primer virus influenza.

• Allantoic cavity: Inokulasi di rongga allantoic digunakan untuk jalur serial dan untuk mendapatkan virus dalam jumlah besar, seperti virus influenza, demam kuning (strain 17D), dan virus rabies (strain Flury) untuk persiapan vaksin. Untuk produksi virus rabies, telur itik digunakan karena ukurannya lebih besar dari telur ayam. Ini membantu dalam produksi virus rabies dalam jumlah besar, yang digunakan untuk persiapan vaksin rabies non-saraf yang tidak aktif.

• Chorioallantoic membrane: Inokulasi beberapa virus pada CAM menghasilkan lesi yang terlihat yang dikenal sebagai pocks. Setiap partikel virus menular menghasilkan satu bintik. Virus cacar, seperti variola atau vaccinia diidentifikasi dengan menunjukkan bopeng khas pada CAM yang diinokulasi dengan virus cacar. Saat ini, di laboratorium virologi, inokulasi embrio ayam telah digantikan oleh kultur sel untuk isolasi virus secara rutin.

Kultur Jaringan

• Kultur sel paling banyak digunakan dalam virologi diagnostik untuk kultivasi dan pengujian virus.
• Kultur jaringan pertama kali diterapkan dalam virologi diagnostik oleh Steinhardt dan rekan pada tahun 1913.
• Mereka mempertahankan virus vaccinia dengan kultur dalam jaringan kornea kelinci. Selanjutnya, Maitland (1928) menggunakan jaringan potong dalam media nutrisi untuk budidaya virus vaksin.
• Enders, Weller, dan Robins (1949) adalah orang pertama yang mengkultur virus polio dalam kultur jaringan yang tidak berasal dari saraf. Sejak itu, sebagian besar virus telah ditanam dalam kultur jaringan untuk diagnosis penyakit virus.
• Berbagai jenis kultur jaringan digunakan untuk menumbuhkan virus. Kultur jaringan dapat terdiri dari tiga jenis yang berbeda sebagai berikut:

Kultur Organ

• Ini digunakan sebelumnya untuk isolasi beberapa virus, yang tampaknya menunjukkan afinitas untuk organ jaringan tertentu. Misalnya, coronavirus, patogen pernapasan, diisolasi dalam kultur organ cincin trakea.

• Dalam metode ini, potongan-potongan kecil organ dipertahankan secara in vitro selama berhari-hari dan berminggu-minggu dengan mempertahankan morfologi dan fungsi aslinya.

• Saat ini, kultur organ tidak digunakan.

Kultur Eksplan

• Dalam metode ini, komponen jaringan cincang ditanam sebagai eksplan yang tertanam dalam bekuan plasma.

• Sebelumnya, kultur eksplan jaringan adenoid digunakan untuk isolasi adenovirus. Metode ini sekarang jarang digunakan dalam virologi.

Kultur sel

• Kultur sel sekarang secara rutin digunakan untuk menumbuhkan virus.

• Dalam metode ini, jaringan dipisahkan menjadi sel-sel komponen dengan perlakuan dengan enzim proteolitik (tripsin atau kolagenase) diikuti dengan pengocokan mekanis.

• Sel-sel kemudian dicuci, dihitung, dan disuspensikan dalam media pertumbuhan yang mengandung asam amino esensial dan vitamin, garam, glukosa, dan sistem penyangga. Media ini dilengkapi hingga 5% serum betis janin dan antibiotik.

• Suspensi sel ditempatkan dalam botol kaca atau plastik, meja, atau cawan Petri.

• Pada inkubasi, sel-sel menempel pada permukaan kaca dan membelah untuk membentuk lembaran sel monolayer yang menutupi permukaan dalam waktu seminggu.

• Kultur sel dapat diinkubasi baik sebagai stationery culture atau sebagai roller drum culture. Yang terakhir ini berguna untuk pertumbuhan beberapa virus rewel karena aerasi yang lebih baik dengan menggulung botol kultur dalam drum rol khusus.

• Kultur sel diklasifikasikan menjadi tiga jenis yang berbeda berdasarkan asal mereka, karakter kromosom, dan jumlah generasi yang mereka dapat dipertahankan.

Kultur sel primer:

• Ini adalah kultur sel normal yang diperoleh secara segar dari jaringan asli yang telah dibudidayakan secara in vitro untuk pertama kalinya dan yang belum disubkultur.

• Kultur sel ini dapat dibuat dari embrio hewan utuh atau dari jaringan terpilih dari dewasa, bayi baru lahir, atau embrio.

• Sel-sel ini memiliki jumlah kromosom diploid normal dan hanya mampu tumbuh terbatas (5-10 divisi) dalam kultur.

• Mereka tidak dapat dipertahankan dalam kultur serial, tetapi dapat disubkultur untuk mendapatkan sejumlah besar.

• Monkey kidney cell culture, human embryonic kidney cell culture, dan chick embryo cell culture adalah contoh umum dari kultur sel primer.

• Primary monkey kidney cell culture sangat berguna untuk isolasi utama myxovirus, paramyxovirus, banyak enterovirus, dan beberapa adenovirus.

Strain sel diploid:

• Strain sel diploid adalah jenis sel tunggal yang mempertahankan nomor kromosom dan kariotipe diploid aslinya. Namun, mereka memiliki karakteristik dan komposisi khusus dan biasanya terdiri dari satu jenis sel dasar.

• Mereka biasanya fibroblas dan dapat dibiakkan untuk maksimum 50 bagian serial sebelum mereka mengalami penuaan (mati) atau mengalami perubahan karakteristik yang signifikan.

• Sel diploid yang berasal dari fibroblas manusia berguna untuk isolasi beberapa virus yang rewel.

• Mereka juga digunakan untuk produksi vaksin; misalnya, embrio manusia WI-38, batang sel paru digunakan untuk budidaya virus rabies, dan sel diploid janin manusia untuk isolasi adenovirus, picornavirus, HSV, CMV, dan VZV.

Continuous cell lines:

• Continuous atau immortal cell lines adalah sel dari satu jenis, yang berasal dari jaringan kanker dan mampu kultivasi serial terus menerus tanpa batas tanpa penuaan.

• Sel biasanya berasal dari Cell lines diploid atau dari jaringan ganas dan memiliki jumlah kromosom yang berubah dan tidak teratur.

• Immortalization dapat terjadi secara spontan atau dapat diinduksi oleh mutagen kimia, virus tumorigenik, atau onkogen. Hep-2, HeLa, dan KB yang berasal dari karsinoma serviks manusia, epitel laring manusia, dan karsinoma nasofaring manusia dan cell lines lainnya sangat baik untuk pemulihan sejumlah besar virus.

• Cell lines ini telah digunakan secara luas untuk pertumbuhan sejumlah virus. Cell lines ini biasanya disimpan pada -70 ° C untuk digunakan bila perlu atau dipelihara oleh subkultur serial.

• Jenis cell lines yang digunakan untuk kultur virus tergantung pada sensitivitas sel terhadap virus tertentu; misalnya, Cell lines Hep-2 sangat baik untuk pemulihan virus syncytial pernapasan, adenovirus, dan HSV.

• Sebagian besar virus dapat diisolasi dengan menggunakan salah satu Cell lines ini.

• Pertumbuhan virus dalam kultur sel dapat dideteksi dengan metode berikut:

Efek sitopatik:

• Banyak virus dapat dideteksi dan awalnya diidentifikasi dengan mengamati perubahan morfologis dalam sel yang dikultur di mana mereka bereplikasi.

• CPE yang dihasilkan oleh berbagai jenis virus adalah karakteristik dan membantu dalam identifikasi awal isolat virus.

• Penyusutan inti, vakuola dalam sitoplasma, pembentukan syncytia, pembulatan, dan pelepasan adalah contoh dari perubahan morfologi sel.

• Sebagian besar CPE dapat ditunjukkan dalam sel monolayer yang tidak tetap dan tidak bernoda di bawah mikroskop berdaya rendah.

• Misalnya, adenovirus menghasilkan perubahan granular besar menyerupai tandan anggur, SV-14 menghasilkan vakuolasi sitoplasma yang jelas, virus campak menghasilkan pembentukan syncytium, virus herpes menghasilkan degenerasi fokus diskrit, dan enterovirus menyebabkan krenasi sel dan degenerasi seluruh lembar sel.

Hemadsorbsi:

• Hemadsorpsi adalah proses adsorpsi eritrosit ke permukaan sel yang terinfeksi yang berfungsi sebagai pengukuran tidak langsung sintesis protein virus.

• Properti ini digunakan untuk mendeteksi infeksi virus noncytocidal serta tahap awal virus cytocidal.

• Virus, seperti virus influenza, virus parainfluenza, virus gondongan, dan togavirus, ketika menginfeksi Cell lines mengkode ekspresi aglutinin sel darah merah, yang diekspresikan pada membran sel yang terinfeksi selama infeksi.

• Hemagglutinin ini mengikat beberapa eritrosit ke permukaan sel yang terinfeksi.

• Kadang-kadang, virus dapat dideteksi dengan aglutinasi eritrosit dalam media kultur.

Interferensi heterolog:

• Properti ini digunakan untuk mendeteksi virus yang tidak menghasilkan CPE klasik di cell lines.

• Dalam metode ini, pertumbuhan virus yang tidak memproduksi CPE dalam kultur sel dapat diuji dengan tantangan berikutnya dengan virus yang diketahui menghasilkan CPE.

• Pertumbuhan virus pertama akan menghambat infeksi oleh virus tantangan sitopatik melalui gangguan.

• Misalnya, virus rubella biasanya tidak menghasilkan CPE, tetapi mencegah replikasi picornavirus, yang diinokulasi sebagai virus tantangan sitopatik.

Transformasi:

• Virus onkogenik yang berhubungan dengan pembentukan tumor menginduksi transformasi sel dan hilangnya inhibisi kontak pada Cell lines yang terinfeksi.

• Hal ini menyebabkan pertumbuhan permukaan yang muncul secara menumpuk yang menghasilkan mikrotumor.

• Contoh virus onkogenik yang menghasilkan transformasi dalam Cell lines adalah beberapa virus herpes, adenovirus, hepadanovirus, papovavirus, dan retrovirus.

Mikroskop cahaya:

• Antigen virus dalam kultur sel yang terinfeksi ditunjukkan dengan pewarnaan sel-sel yang terinfeksi virus dari bagian jaringan dengan antibodi virus spesifik yang terkonjugasi dengan horseradish peroxidase.

• Ini diikuti dengan penambahan hidrogen peroksida bersama dengan zat turunan benzidin.

• Dalam reaksi positif, endapan merah tidak larut diendapkan pada Cell lines, yang ditunjukkan dengan pemeriksaan di bawah mikroskop cahaya biasa.

Imunofluoresensi:

• Imunofluoresensi langsung menggunakan antibodi spesifik sering digunakan untuk mendeteksi antigen virus dalam Cell lines yang diinokulasi untuk identifikasi virus.

Mikroskop elektron:

• Virus juga dapat ditunjukkan dalam Cell lines yang terinfeksi oleh EM.