Genom Virus Monkeypox 2022

Read Also

Monkeypox virus (MPXV) adalah virus double-stranded DNA milik genus Orthopoxviruses. Ini adalah virus zoonosis endemik ke Afrika Barat dan Tengah yang menghasilkan gejala yang mirip dengan yang terlihat di masa lalu pada pasien cacar, meskipun secara klinis kurang parah. Wabah virus Monkeypox terdeteksi di beberapa negara non-endemik, terutama di Eropa pada Mei 2022. Virus ini menyerang terutama pria yang melakukan hubungan seksual dengan pria yang telah melaporkan hubungan seksual baru-baru ini dengan pasangan baru atau banyak.

Sejak 1 Januari 2022, kasus cacar monyet telah dilaporkan ke WHO, dan per 7 Juli, total 7.892 kasus yang dikonfirmasi laboratorium telah dilaporkan ke WHO. Mayoritas kasus yang dikonfirmasi berasal dari kawasan Eropa (6.496). Kasus yang dikonfirmasi juga telah dilaporkan di Wilayah Amerika (1.184), Wilayah Afrika (173), Wilayah Mediterania Timur (15), dan Wilayah Pasifik Barat (24). Pada 17 Juni 2022, Chili melaporkan kasus pertama virus Monkeypox: seorang dewasa dari Wilayah Metropolitan dengan riwayat perjalanan ke Eropa yang menunjukkan gejala eksantema mendadak (bintik-bintik pada kulit), lesi vesikulasi, keropeng kulit, disertai pembusukan. dan limfadenopati.

Deskripsi metode

Semua kasus yang mencurigakan diproses sesuai dengan pedoman yang disarankan oleh World Health Organization (WHO). DNA diekstraksi dari jaringan menggunakan NucliSENS EasyMag (Biomérieux). Sampel dikonfirmasi sebagai positif oleh real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) dengan nilai ct di bawah 35 dan Sanger sequencing dari gen F3L, F4L, E5R, dan N3R. Amplikon tersebut diperoleh dengan PCR menggunakan primer spesifik, disintesis, dan dimurnikan di fasilitas kami (Tabel 1). SapphireAmp Fast PCR Master Mix (Cat. No. RR350B, Takara), digunakan untuk reaksi PCR dengan metode running pada suhu 95°C selama 2 menit, dilanjutkan dengan 45 siklus pada suhu 95°C selama 15 detik, 52°C selama 15 detik, dan 72°C selama 15 detik.

Tabel 1: Daftar primer yang digunakan untuk identifikasi MPXV dengan Sanger sequencing.

Primer name	Gen	Target	Sequence
MPXV_E5R_F	E5R	MPXV	ATGTTGATATTAATAATCGTATTGTGGT
MPXV_E5R_R	E5R	MPXV	AAAGTCAATGCACTCTTAAAGATTCTCAA
F4L_F	F4L	Orthopoxvirus	CGTTGGAAAACGTGAGTCCGG
F4L_R	F4L	Orthopoxvirus	ATTGGCGTTTTTTGCAGCCAG
F3L-F290	F3L	MPXV	CTCATTGATTTTTCGCGGGATA
F3L-500-Rv	F3L	MPXV	TTACAACGCAATCGATACATG
N3R-F319	N3R	MPXV	AACAACCGTCCTACAATTAAACAACA
N3R-500-Rv	N3R	MPXV	TAATGCAGATATAATATCTTT

Untuk seluruh pengurutan genom, DNA yang diekstraksi diukur menggunakan fluorimetri dengan Qubit dsDNA High Sensitivity Assay (Cat. Q32854, Life Technologies) pada instrumen Qubit 2.0. Metagenomics senapan dilakukan dalam duplikat menggunakan 100 ng DNA yang diekstraksi menggunakan Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Cat. 20018705, Illumina) dan pengurutan ujung berpasangan (2x250 bp) pada Illumina Miseq dengan sekitar ~25 juta total pembacaan dengan 88% > Q30.

File FASTQ Illumina yang dipasangkan telah diproses sebelumnya menggunakan saluran internal untuk remove adapters dan low-quality sequences. Urutan berkualitas tinggi disisipkan menggunakan reformat tool dari BBMap2 V.38.68 software untuk menghasilkan satu file Fastq yang disisipkan. Kedua, bacaan terkait manusia depleted menggunakan NCBI SRA Human Scrubber (v.1.1.2021-05-05). Bacaan yang tersisa digunakan untuk langkah-langkah berikut. Analisis reference-based dilakukan dengan pembacaan Illumina yang dipetakan ke referensi MPXV_USA_2022_MA001 (aksesi GenBank: ON563414.3) dengan menggunakan BWA⁶ software tool v.0.7.17-r1188. Pada tahap ini, metrik duplikat dari PICARD v.2.23.1 (Picard Tools - By Broad Institute), dan coverage metricdari SAMtools v.1.6 diperoleh dari urutan analisis yang tersisa. Selanjutnya, pemanggilan varian dilakukan menggunakan iVar v.1.0 menggunakan parameter default terhadap referensi (aksesi GenBank: ON563414.3). Urutan konsensus dalam format FASTA diperoleh dengan menggunakan metodologi pileup dari SAMtools ditambah opsi konsensus dari iVar seperti yang dijelaskan dalam karya sebelumnya.

Persentase non-human mapped read adalah 15,36%, dengan kedalaman rata-rata 200X, mencakup 100% genom referensi (197.205 bp). Urutan genom konsensus telah diserahkan ke GISAID dengan entri EPI_ISL_14224334 dan juga tersedia di bawah NCBI SRA Accession Number PRJNA865735.

Untuk rekonstruksi filogenetik, kami memilih subset dari 95 genom perwakilan dari asal dan clades yang berbeda. Genom representatif yang digunakan mencakup 73 sekuens dari wabah 2022 baru-baru ini; semua sekuens yang digunakan diperoleh dari proyek nextstrain/monkeypox. Pohon filogenetik dibangun menggunakan nextstrain pipeline untuk cacar monyet di https://github.com/nextstrain/monkeypox/hmpxv1, yang difokuskan pada penularan dari manusia ke manusia (“wabah baru-baru ini”). Alat yang digunakan adalah nextalign untuk sequence alignment, IQ-tree dengan model GTR untuk rekonstruksi filogenetik, dan TreeTime untuk rekonstruksi ancestral dan inferensi temporal. Newick tree yang dihasilkan divisualisasikan menggunakan online tool Microreact bersama dengan metadata yang terkait dengan sampel yang diperoleh dari nextstrain/monkeypox.

Gambar 1. Pohon filogenetik Maximum-Likelihood (model GTR) untuk 95 genom Monkeypox yang tersedia, termasuk pilihan 73 sekuens dari wabah 2022. Genom yang disorot sesuai dengan urutan genom kasus Chili pertama. Peta sisi kanan menunjukkan distribusi genom yang dianalisis yang diwarnai oleh clade.

Metode sekuensing Sanger dari fragmen gen F3L, N3R, F4L dan E5R memungkinkan identifikasi virus monkeypox. Analisis awal (Gambar 1) menunjukkan bahwa genom yang diperoleh milik clade MPXV Afrika Barat dan paling dekat hubungannya dengan genom dari wabah 2022.

Referensi

Alakunle, E., Moens, U., Nchinda, G., & Okeke, M. I. (2020). Monkeypox Virus in Nigeria: Infection Biology, Epidemiology, and Evolution. Viruses, 12(11), 1257.

PAHO, Epidemiological Update on Monkeypox - 9 July 2022. Epidemiological Update on Monkeypox - 9 July 2022 - PAHO/WHO | Pan American Health Organization

Laboratory testing for the monkeypox virus: Interim guidance, 23 May 2022, Laboratory testing for the monkeypox virus: Interim guidance 2

Katz, K. S., Shutov, O., Lapoint, R., Kimelman, M., Brister, J. R., & O’Sullivan, C. (2021). STAT: a fast, scalable, MinHash-based k-mer tool to assess Sequence Read Archive next-generation sequence submissions. Genome biology, 22(1), 1-15.

Gigante, C. M., Smole, S., Wilkins, K., McCollum, A., Hutson, C., & Davidson, W. (2022). Draft monkeypox virus genome from confirmed monkeypox case in Massachusetts, United States. 2022.

Li, H., & Durbin, R. (2010). Fast and accurate long-read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics, 26(5), 589-595.

Danecek, P., Bonfield, J. K., Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, M. O., … & Li, H. (2021). Twelve years of SAMtools and BCFtools. Gigascience, 10(2), giab008.

Grubaugh, N. D., Gangavarapu, K., Quick, J., Matteson, N. L., De Jesus, J. G., Main, B. J., Tan, A. L., Paul, L. M., Brackney, D. E., Grewal, S., Gurfield, N., Van Rompay, K., Isern, S., Michael, S. F., Coffey, L. L., Loman, N. J., & Andersen, K. G. (2019). An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome biology, 20(1), 8.

Isidro, J., Borges, V., Pinto, M., Sobral, D., Santos, J. D., Nunes, A., Mixão, V., Ferreira, R., Santos, D., Duarte, S., Vieira, L., Borrego, M. J., Núncio, S., de Carvalho, I. L., Pelerito, A., Cordeiro, R., & Gomes, J. P. (2022). Phylogenomic characterization and signs of microevolution in the 2022 multi-country outbreak of monkeypox virus. Nature medicine, 10.1038/s41591-022-01907-y. Advance online publication.

Hadfield, J., Megill, C., Bell, S. M., Huddleston, J., Potter, B., Callender, C., … & Neher, R. A. (2018). Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics, 34(23), 4121-4123.

Nguyen, L. T., Schmidt, H. A., Von Haeseler, A., & Minh, B. Q. (2015). IQ-TREE: a fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies. Molecular biology and evolution, 32(1), 268-274.

Sagulenko, P., Puller, V., & Neher, R. A. (2018). TreeTime: Maximum-likelihood phylodynamic analysis. Virus evolution, 4(1), vex042.

Argimón, S., Abudahab, K., Goater, R. J., Fedosejev, A., Bhai, J., Glasner, C., … & Aanensen, D. M. (2016). Microreact: visualizing and sharing data for genomic epidemiology and phylogeography. Microbial genomics, 2(11).