Rapid Amplicon Nanopore Sequencing (RANS) untuk Diagnosis Diferensial Virus Monkeypox

Read Also

Pada Juli 2022, lebih dari 16.000 kasus monkeypox (MPX) yang dikonfirmasi laboratorium, termasuk satu kematian, telah dilaporkan ke WHO di lebih dari 40 negara. Wabah MPX terus terutama mempengaruhi pria yang telah melaporkan hubungan seks baru-baru ini dengan pasangan pria baru atau banyak. Sampai saat ini, MPX adalah penyakit virus langka yang jarang terdeteksi di luar Afrika, dan alasan kemunculan MPX yang cepat dan global masih sulit dipahami. Virus MPX termasuk dalam genus Orthopoxvirus (OPV) dalam keluarga Poxviridae yang mencakup lebih dari 70 anggota virus genom DNA besar (kira-kira 200.000 bp) yang mengkodekan sekitar 200 protein dan bereplikasi dalam sitoplasma sel yang terinfeksi. Famili ini dibagi lagi menjadi dua subfamili, Entomopoxvirinae dan Chordopoxvirinae, yang masing-masing menginfeksi serangga dan vertebrata. Chordopoxvirinae telah dibagi lagi menjadi delapan genera (OPV, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus, Parapoxvirus, Suipoxvirus, dan Yatapoxvirus). Dalam genus OPV, hanya lima yang dapat menginfeksi manusia: virus Variola, virus MPX, virus Vaccinia, virus Cowpox, dan virus Camelpox, terutama melalui epitel saluran napas melalui aerosol atau melalui kulit. Virus variola, anggota genus OPV, adalah agen penyebab cacar, yang merupakan masalah kesehatan dan biosekuriti utama. Cacar adalah penyakit spesifik manusia yang sangat menular dengan kematian berlebihan hingga 40% pada populasi yang tidak divaksinasi. Diperkirakan penyakit cacar telah membunuh sekitar 300-500 juta orang selama abad ke-20. Cacar adalah penyakit virus pertama dalam sejarah manusia yang telah diberantas. Pada tahun 1980, World Health Organization (WHO) mengesahkan pemberantasan virus Variola setelah kampanye vaksinasi yang sukses di seluruh dunia. Sejak itu, satu-satunya sampel virus cacar yang diketahui telah disimpan di gudang khusus di Rusia dan Amerika Serikat.

Setelah pemberantasan cacar, kampanye vaksinasi berhenti dan kekebalan populasi terhadap cacar dan penyakit terkait OPV telah menurun secara signifikan. Sejak itu, kasus sporadis kasus MPX telah dilaporkan, terutama di Afrika. Diagnosis banding antara virus yang menyebabkan ruam dan lesi vesikular terkadang sulit, terutama dengan munculnya patogen di daerah non-endemik. Wabah MPX saat ini memang menantang kemampuan diagnosis banding dan menekankan pentingnya diagnosis OPV dan patogen pembentuk vesikel lainnya. Potensi rekombinasi OPV, dalam hubungannya dengan kemampuan luar biasa untuk melintasi penghalang spesies hewan, secara substansial meningkatkan potensi patogennya. Pengembangan metode yang andal dan cepat untuk deteksi sensitif MPXV dan diskriminasi akurat antara anggota OPV sebelumnya dan lainnya atau patogen pembentuk vesikel tambahan sangat penting. Tidak dapat diaksesnya virus Variola dan tingginya tingkat kesamaan genetik dalam kelompok OPV (lebih dari 95% kesamaan pada tingkat DNA) membatasi kemampuan untuk mengembangkan tes diagnostik yang andal. Beberapa pendekatan telah digunakan untuk identifikasi MPXV dan diferensiasi antara anggota OPV, termasuk pertumbuhan khas pada membran chorioallantoic, serologi, dan pemetaan dengan enzim restriksi DNA. Baru-baru ini, Luciani et al. mengembangkan uji PCR real-time yang menargetkan wilayah genom poxvirus yang sangat terkonservasi, sehingga memungkinkan deteksi pan-poxvirus yang sensitif. Namun, metode ini kurang dalam potensi diagnosis banding untuk virus dalam genus OPV.

Deteksi MPXV paling spesifik didasarkan pada tes real-time PCR. Tes yang dikembangkan oleh Li et al. dan Maksyutov dkk. dapat mendiagnosis MPXV dan membedakan antara clade Afrika Barat dan clade Afrika Tengah. Diagnosis banding ini penting; karena penyakit strain Afrika Tengah biasanya disertai dengan gejala yang mirip dengan cacar biasa dan memiliki tingkat kematian kasus sekitar 10% pada populasi yang tidak divaksinasi, sedangkan strain Afrika Barat tampaknya menyebabkan penyakit yang kurang parah.

Beberapa pendekatan deteksi genetik dikembangkan untuk diskriminasi cepat anggota OPV, termasuk tes PCR konvensional dengan atau tanpa analisis RFLP amplikon, tes real-time PCR, dan PCR yang diikuti dengan tes cross-hybridizationyang menggunakan dot-blot atau microarray untuk analisis diferensial. Teknik-teknik ini dapat membedakan antara OPV menular manusia yang diketahui (Vaccinia, Variola, Cowpox, atau MPX) sampai batas yang dapat diandalkan, tetapi biasanya gagal untuk menentukan patogen pembentuk vesikel dalam sampel yang dicurigai jika bukan dari kelompok OPV. Selain itu, metode yang disebutkan di atas tidak dapat membedakan antara clade dalam spesies yang sama, yang mungkin penting dalam wabah baru. High-throughput sequencing (HTS) saat ini merupakan teknik standar emas untuk diskriminasi genomik diferensial yang optimal, tetapi kelayakan menggunakan metode berbasis HTS untuk diagnosis banding virus pembentuk vesikel terhambat oleh tingginya, terutama manusia, genomik. latar belakang dalam sampel klinis, meningkatkan kebutuhan untuk isolasi dan penyebaran virus, yang memakan waktu dan tenaga. Di masa lalu, kami mengatasi tantangan ini dengan memanfaatkan sistem deteksi berbasis microarray, yang didasarkan pada pendekatan ekstensi primer yang tersusun, untuk mendeteksi single nucleotide polymorphisms (SNPs) diferensial. Meskipun sistem ini dapat diandalkan, tetapi juga padat karya dan waktu, ketinggalan zaman, dan mahal.

Studi saat ini bertujuan untuk menyediakan alat diagnostik cepat untuk deteksi genetik MPXV yang akurat dan spesifik dan spesies yang terkait erat, serta patogen pembentuk vesikel lainnya, yang dapat menyebabkan kesalahan diagnosis. Kami mengembangkan pendekatan yang kami sebut termed rapid amplicon nanopore sequencing (RANS) yang didasarkan pada teknologi pengurutan Oxford Nanopore. Pendekatan ini sangat akurat, cepat, dan murah.

Gambar 1. Pendekatan RANS untuk diagnosis banding MPXV dan patogen pembentuk vesikel lainnya. Gambar tersebut menguraikan prosedur RANS yang cepat dan komprehensif. Prosedur dimulai dengan sampel klinis yang dicurigai dan diakhiri dengan identifikasi berbasis urutan tertentu dalam jangka waktu beberapa jam. (I). Multiplex PCR amplification, di mana primer yang saling menguntungkan untuk sekelompok virus (misalnya OPV) digunakan untuk memperkuat seluruh kelompok. Sebuah 5′ fosfat (menggunakan primer terfosforilasi) dan ekor dA (menggunakan aktivitas transferase terminal DNA polimerase dan langkah perpanjangan akhir 15 menit) secara bersamaan ditambahkan pada tahap ini. Selanjutnya (II), ligasi adaptor dilakukan, di mana ONT-proprietary adapters, yang dilekatkan pada enzim motorik, diikat ke ujung untaian. Langkah terakhir (III) melibatkan library loading, sequencing, dan base calling: Amplikon dimuat ke peralatan Flongle dan file FASTQ yang disebut berbasis dihasilkan saat DNA ditranslokasikan melalui nanopori. Akhirnya, perbandingan bioinformatika antara urutan yang dihasilkan ke database yang relevan menunjukkan agen spesifik.

Untuk deteksi patogen pembentuk vesikel berbasis RANS, kami awalnya mengumpulkan daftar patogen yang relevan. Daftar tersebut mencakup 14 spesies virus, yang semuanya memiliki sekuens genomik lengkap dalam database, menyebabkan penyakit menular yang terkait dengan vesikel, cenderung salah didiagnosis sebagai MPX. Patogen dalam daftar dipilih sesuai dengan kriteria berikut: gambaran klinis dan kemiripan gejala (pembentukan vesikel), kejadian penyakit, tingkat keparahan penyakit pada manusia, tingkat kematian, dan infektivitas manusia. Secara alami, lima anggota genus OPV yang secara genetik dan morfologi mirip dengan MPX dimasukkan dalam daftar (Tabel 1). 14 patogen milik dua subfamili utama: Chordopoxvirinae dan Alphaherpesvirus. Patogen dalam setiap kelompok terkait erat dan memiliki tingkat kesamaan urutan yang tinggi. Dalam pekerjaan sebelumnya, kami menemukan sembilan wilayah diagnostik diferensial potensial yang dirinci dalam Tabel 1. Wilayah ini berisi urutan homologi di termini mereka yang memungkinkan desain dan penggunaan primer umum untuk amplifikasi PCR multipleks dari wilayah diagnostik dari semua yang terkait patogen dalam subkelompok tertentu. Fragmen yang diperkuat menyimpan SNP diagnostik yang dapat digunakan untuk identifikasi spesifik setiap patogen.