Amplifikasi Gen Hormon Pertumbuhan

Read Also

        Urutan nukleotida hormon pertumbuhan ikan mas dan ikan nila diamplifikasi dari DNA genom hasil isolasi kedua ikan tersebut dengan PCR menggunakan primer penyandi biosintesis gen hormon pertumbuhan. Primer untuk gen hormon pertumbuhan ikan mas Majalaya yaitu primer Forward (F) : 5’ TAATGAGAATGCAGAGGG 3’ dan primer Reverse (R) : 5’ CAGAAAGACAGAGGGAAG 3’ (Hinitz & Moav, 1999). Untuk menyandi biosintesis gen hormon pertumbuhan ikan nila GIFT pada DNA genom digunakan primer F : 5’ –CAGCGTCTCAGCCTCACTTTGAG- 3’ dan primer    R : 5’ –AAGATTCCGTTTTAAGCTCAG- 3’ (Morales et al. 2001).

Komponen-komponen yang digunakan dalam pengerjaan amplifikasi dengan mesin PCR (thermocycler) yaitu kit PCR Core System I, sampel DNA (template), dan primer dengan mengatur secara otomatis suhu, waktu dan jumlah siklus yang diperlukan. Setiap siklus amplifikasi PCR terdiri atas jumlah yang ditentukan tahapan-tahapan reaksi. Tahapan-tahapan dirancang menggunakan suhu dan lamanya waktu untuk mendenaturasi template, menempelkan (annealing) primer-primer dan memanjangkan rantai nukleotida DNA dengan cara polimerisasi.

Suhu annealing  untuk reaksi PCR template ikan nila dan ikan mas sebesar 48 ⁰C dan 4 macam  konsentrasi MgCl₂ dalam komponen reaksi PCR yaitu MgCl₂ 1,5 mM ; MgCl₂ 1,75 mM ; MgCl₂ 2,0 mM dan MgCl₂ 2,25 mM guna memperoleh produk amplifikasi sekuen gen GH ikan nila dan mas yang jelas (Tabel 1).

            Tabel 1. Formula campuran bahan dalam reaksi PCR

            Table 1. Mixed material formula used in PCR process

Komponen reaksi Reaction component	MgCl2 1,5 mM 1.5 mM MgCl2	MgCl2 1,75 mM 1.75 MgCl2	MgCl2 2,0 mM 2.0 mM MgCl2	MgCl2 2,25 mM 2.25 mM MgCl2
1. MgCl2 2. Bufer 10 x 3. dNTP 4. Primer (F) 5. Primer (R) 6. Taq DNA Poly 7. DNA template 8. Air Deion	3 ml 5 ml 1 ml 2 ml 2 ml 0,25 ml 2 ml 34,75 ml 50 ml	3,5 ml 5 ml 1 ml 2 ml 2 ml 0,25 ml 2 ml 34,25 ml 50 ml	4 ml 5 ml 1 ml 2 ml 2 ml 0,25 ml 2 ml 33,75 ml 50 ml	4,5 ml 5 ml 1 ml 2ml 2 ml 0,25 ml 2 ml 33,25 ml 50 ml

Tahap selanjutnya dilakukan pengaturan suhu untuk proses denaturasi awal, denaturasi, penempelan primer (annealing) dan pemanjangan nukleotida (extension) pada thermocycler seperti yang disajikan dalam Tabel 2.

Tabel 2. Pengaturan suhu untuk tahapan amplifikasi proses PCR

Table 2. Temperature settings for stages in PCR amplification process

Tahapan Phase	Suhu Temperature	Waktu Time	Jumlah Siklus Cycles number
Denaturasi Awal (Initial Denaturation)	94 0C 94 0C	2 menit 2 minute	1 siklus 1 cycles
Siklus PCR : PCR cycles 1. Denaturasi (Denaturation) 2. Annealing 3. Extension (Extention)	94 0C 48 0C 72 0C	1 menit (1 minute) 1 menit (1 minute) 1 menit (1 minute)	30 siklus 30 cycles
Penstabilan (Final extention)	72 0C	7 menit (1 minute)	1 siklus (1 cycles)