Platform Vaksin Berbasis Nanopartikel dan Mikropartikel

Read Also

Pengiriman antigen oleh mikro atau nanopartikel adalah alternatif mutakhir serbaguna untuk mendorong tanggapan terhadap patogen yang muncul atau muncul kembali, wabah penyakit, epidemi dan pandemi, karena aman (tidak adanya bahan menular), DIVA (differentiating between infected and vaccinated animals), stabil secara termal dan kimia dan produksi skala besar terjangkau. Berbagai teknologi dapat digunakan sebagai pembawa antigen atau dapat dengan mudah dikonjugasikan dengan epitop untuk menyesuaikan kimia dan imunogenisitasnya. Partikel lipid pembawa antigen termasuk sistem pengiriman berbasis liposom, selain dari penggunaannya sebagai pembawa asam nukleat atau peningkatan kemanjuran adjuvant, telah banyak dieksplorasi sebagai alat yang menjanjikan untuk desain vaksin. Extracellular vesicles (EVs), partikel bilayer berbasis lipid kecil yang secara alami disekresikan oleh semua jenis sel, virosom dan nanopartikel lipid squalene juga mewakili sistem pengiriman berbasis lipid yang potensial. Platform pengiriman berbasis nanocarrier atau microcarrier non-lipidic biodegradable juga telah dinilai, terutama konstruksi karbohidrat dan dendrimer. Nano dan mikropartikel polimer yang paling umum adalah yang didasarkan pada poli (asam α-hidroksi) seperti Food and Drug Administration (FDA) dan European Medicine Agency (EMA)-approved poly(lactic-coglycolic acid) (PLGA) atau poly(lactic acid) (PLA) berbasis nanopartikel. Selain itu, asam poli-amino, seperti poly(γ-glutamic acid) (γ-PGA), poli(ε-lisin) atau poli(L-arginin), dan polisakarida seperti kitosan, alginat atau dekstran, juga telah dikembangkan. Dendrimer (biasanya dendrimer olypropyleneimine (PPI) dan polyamido amine (PAMAM)) juga merupakan platform yang menarik karena struktur bercabangnya yang terdefinisi dengan baik dan fleksibilitas struktural yang menawarkan kemungkinan mengenkapsulasi atau menggabungkan antigen vaksin fungsional. Selain itu, senyawa anorganik seperti emas (AuNPs), perak (AgNPs), silika atau karbon dapat digunakan untuk pembuatan struktur nano yang aman, dapat direproduksi, dan berbiaya rendah untuk meningkatkan pengiriman antigen.

Sistem nanopartikel berbasis protein yang Self-assembled mencakup beberapa pendekatan seperti viral-like particles (VLPs), heat shock protein “cages”, kompleks enzim, chaperones dan feritin yang sangat terkonservasi, yang membentuk cangkang protein tetracosameric yang stabil yang dapat mencakup antigen heterolog. Meskipun demikian, VLP telah mengumpulkan perhatian paling besar, dengan lebih dari 110 VLP dibangun dari virus yang berasal dari berbagai keluarga. VLP adalah struktur skala nano yang terdiri dari protein virus Self-assembly yang tidak memiliki materi genetik, sehingga tidak dapat bereplikasi dan sebagai konsekuensinya tidak patogen. VLP menyajikan geometri yang terdefinisi dengan baik, biasanya ikosahedron atau struktur seperti batang dengan diameter dalam kisaran 25-100 nm, meniru keseluruhan organisasi dan struktur konformasi virion asli, sehingga menyerupai fitur imunogenik dari virus alami. Struktur protein ini didasarkan pada kemampuan intrinsik alami dari beberapa protein virus struktural, seringkali protein utama dalam kapsid atau selubung, dan juga protein inti yang secara spontan self-assemble menjadi VLP ketika diekspresikan dalam sistem ekspresi rekombinan. VLP dapat digunakan sebagai kandidat vaksin atau vektor untuk presentasi antigen atau ligan asing atau untuk penghantaran obat. VLP mewakili patogen-associated molecular pattern (PAMPs) karena strukturnya yang berulang dan multimerik yang menyerupai virus tipe liar, dideteksi oleh inang, berinteraksi langsung dengan antigen-presenting cells (APCs), sebagai dendritic cells (DC), dan memicu respon imun adaptif. Selain itu, mereka menghadirkan stabilitas yang lebih tinggi daripada antigen terlarut dan memiliki sifat DIVA, karena VLP tidak menggabungkan semua antigen virus. Karena fitur ini, VLP dapat dimanfaatkan sebagai kandidat vaksin yang aman dan serbaguna untuk melawan infeksi virus. VLP menyiratkan beberapa tantangan teknis yang signifikan, misalnya, stabilitas dan ketidakstabilan yang rendah di seluruh pemrosesan hilir, ekspresi variabel protein yang berbeda antara sistem ekspresi dan co-purification yang dapat mempengaruhi imunogenisitas VLP. Sejak 1986, ketika FDA pertama kali menyetujui vaksin berbasis VLP rekombinan terhadap hepatitis B virus (HBV), beberapa VLP terhadap penyakit menular yang berbeda mengikuti: Gardasil® (Merck and Co., Inc., Kenilworth, NJ, USA), Gardasil9 ® (Merck and Co., Inc.) dan Cervarix® (GlaxoSmithKline Inc., Brentford, UK) terhadap virus papiloma manusia; Sci-B-Vac™ (VBI Vaccines, Cambridge, MA, USA) dan Hecolin® (Xiamen Innovax Biotec, Xiamen, China) masing-masing terhadap virus Hepatitis B dan E; Mosquirix™ (Glaxo-SmithKline Inc.) terhadap Plasmodium falciparum, agen malaria; dan banyak lainnya saat ini sedang dievaluasi dalam uji klinis. VLP semakin dianggap sebagai vaksin hewan. Sampai saat ini, hanya vaksin porcine circovirus tipe 2 (PCV2) VLP Porcilis PCV® (Intervet International, Boxmeer, Belanda) dan Ingelvac CircoFLEX1® (Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Jerman) yang telah dilisensikan untuk tujuan kedokteran hewan. Namun, VLP telah dihasilkan dari spektrum luas penyakit virus hewan, seperti AHSV, avian influenza virus (AIV), BTV, foot and mouth disease virus (FMDV), Newcastle disease virus (NDV), porcine parvovirus (PPV) dan Rift Valley fever virus (RVFV).

Self-assembled protein nano- atau mikroplatform dapat secara eksperimental dihasilkan di bawah kondisi laboratorium dalam berbagai sistem ekspresi berbasis sel termasuk cell lines mamalia, sel prokariotik, ragi dan cell lines serangga. Bakteri adalah platform ekspresi pertama yang digunakan untuk ekspresi biologi—senyawa farmasi yang disintesis atau diekstraksi dari sumber biologis, misalnya antibodi monoklonal, modulator reseptor, modulator enzim atau vaksin dan merupakan yang paling banyak digunakan karena pertumbuhannya yang cepat, kemudahan penanganan dan biaya rendah. Namun, mereka tidak dapat melakukan modifikasi pasca-translasi, ada potensi kontaminasi dengan endotoksin dan penggunaan kodon “rare” atau pelipatan protein yang salah dibandingkan dengan sel eukariotik dapat menyebabkan kadar protein rendah atau produk yang tidak berguna. Dalam ragi, protein yang gagal melipat telah dikaitkan dengan kultur kepadatan sel yang tinggi. Cell lines mamalia dan serangga mencapai hasil protein yang tinggi dan dapat melakukan modifikasi pasca-translasi, meskipun pada beberapa sel mamalia dan pada cell lines serangga modifikasi ini dapat berbeda dari sel manusia, yang mengarah ke biologi imunogenik yang dapat dikenali sebagai “foreign”oleh sistem imun. Pertanian molekuler—istilah yang digunakan untuk menggambarkan penggunaan tanaman atau sel tanaman untuk menghasilkan biologi telah diimplementasikan untuk produksi vaksin berbasis VLP terhadap sejumlah besar virus. Ekspresi sementara pada tanaman memungkinkan ekspresi sukses dari partikel telanjang dan terbungkus, dan struktur tergantung pada satu atau lebih protein virus. Keuntungan dari teknologi ini, misalnya, keamanannya dibandingkan dengan sistem ekspresi yang disebutkan di atas, kemungkinan rekayasa glikosilasi tipe manusia dan skalabilitasnya yang mudah, membuatnya lebih menarik dan mudah diakses untuk pembuatan vaksin nano atau mikropartikel protein Self-assembly. Baru-baru ini, studi skala besar pertama dari setiap vaksin manusia yang diturunkan dari tumbuhan — VLP quadrivalen terhadap virus influenza — menunjukkan bahwa VLP yang berasal dari tumbuhan dapat memberikan perlindungan substansial terhadap patogen virus tanpa masalah keamanan Kandidat vaksin VLP lainnya terhadap rotavirus dan SARS-CoV-2 berada di bawah evaluasi klinis fase I, II dan III.

µNS Avian Reovirus Protein sebagai Sistem Pembawa Antigen

Salah satu genus yang menyusun famili Spinareoviridae adalah genus Orthoreovirus. Virus yang termasuk dalam genus ini memiliki sepuluh segmen genom dsRNA di dalam lapisan protein ganda dengan diameter luar 70-90 nm. Non-fusogenik mammalian reoviruses (MRVs) dan fusogenik avian reoviruses (ARVs) utama adalah anggota prototipe dari genus ini. ARV, seperti semua reovirus lainnya, membuat kompartemen intraseluler tanpa membran untuk replikasi virus, yang diberi nama “viral inclusion bodies” atau “viroplasma”. Perancah di mana viroplasma dibangun dibuat oleh protein non-struktural virus muNS, yang pertama-tama menarik sigmaNS protein non-struktural yang mengikat RNA, dan kemudian bersama-sama mereka secara selektif dan teratur memuat viroplasma dengan semua komponen virus lainnya. Protein muNS dikodekan oleh kerangka baca tunggal gen ARV M3. Protein virus non-struktural asam amino 635 ini (70,8 kDa) mampu membentuk inklusi teratur ketika diekspresikan secara individual dalam sel yang ditransfeksi dan hanya memiliki kesamaan 28,3% dengan rekan reovirus mamalianya. Wilayah C-terminal dari urutan muNS sangat penting untuk pembentukan inklusi. Sebaliknya, tidak ada perubahan yang diamati dalam kapasitas untuk membentuk inklusi atau bentuk dan perilakunya setelah eliminasi 140 asam amino terminal-N pertama. Namun, eliminasi lebih lanjut dari residu N-terminal hingga residu 448 menghasilkan pembentukan inklusi yang lebih kecil, teratur dan bulat. Setiap penghapusan tambahan mengakibatkan hilangnya total kemampuan untuk membentuk inklusi, sehingga menunjukkan bahwa fragmen antara residu 448 dan 635 adalah porsi minimal protein muNS yang tetap mampu membentuk inklusi secara efisien dan kemudian diberi nama muNS-Mi. MuNS-Mi diberi nama muNS-mikrosfer (muNS-MS) karena ukurannya berada dalam kisaran mikrometer ketika diproduksi dalam sistem ekspresi sel serangga-baculovirus (Gambar). Analisis sekuens MuNS-Mi mengungkapkan adanya dua wilayah berbeda dengan probabilitas tinggi untuk membentuk struktur kumparan-kumparan yang ditetapkan sebagai domain Coil1 (C1) dan Coil2 (C2). Domain di antara C1 dan C2 disebut domain Intercoil atau IC (residu 477 hingga 539), sedangkan residu C-terminal 61 terdiri dari domain C-Tail (CT). Domain IC adalah salah satu aktor utama dalam pembentukan inklusi, karena mutasi titik pada dua residu yang sangat terkonservasi (His 487 dan Cys 489) menyebabkan hilangnya kemampuan untuk membentuk inklusi. Karena domain IC menunjukkan afinitas yang sangat tinggi untuk muNS, inklusi muNS-Mi dan muNS-MS, ia kemudian digunakan sebagai "tag" molekuler. Metodologi yang disebut “IC-Tagging” terdiri dari dua komponen: protein muNS-Mi yang membentuk muNS-MS intraseluler ketika diekspresikan sendiri; dan domain IC yang dapat menyatu dengan protein apa pun yang diinginkan baik pada terminal amino atau karboksil tanpa mengubah pelipatan protein, aktivitas, atau lokasi selulernya. Tag IC memaksa relokasi protein yang ditandai ke muNS-MS ketika ekspresi bersama dari kedua komponen ini terjadi. Protein yang dimasukkan ke dalam muNS-MS oleh IC-Tagging terlipat dengan baik dan bahkan terjadi pembentukan oligomer.

Gambar Metodologi IC-Tagging memungkinkan penggabungan antigen tertentu ke dalam partikel muNS. Ekspresi bakteri mengarah ke nanosfer yang memuat epitop self-adjuvant ~ 400 nm sedangkan ekspresi berbasis baculovirus menghasilkan mikrosfer dengan diameter antara 1-4 m.

Meskipun platform awalnya dikembangkan dalam sel eukariotik, di mana diameter rentang muNS-MS antara 1 dan 4 m, itu juga diadaptasi untuk bekerja pada bakteri, di mana bola memiliki diameter sekitar 400 nm (nanospheres, muNS-NS) (Gambar). Oleh karena itu, teknologi ini juga dapat memanfaatkan kemampuan partikel berukuran nano untuk mengoptimalkan pengambilan antigen atau mendorong respons Th1. Selain itu, versi bakteri mudah ditangani dan hemat biaya untuk produksi protein, menambahkan keserbagunaan pada metodologi, dan memungkinkan produksi protein atau enzim yang dienkapsulasi untuk penggunaan yang berbeda. Selain itu, metodologi IC-Tagging diadaptasi untuk bekerja di dalam endoplasmic reticulum (ER). Dengan menggunakan G glikoprotein dari vesicular stomatitis virus (VSV) dan protein Gn dari Rift Valley fever virus (RVFV), ditunjukkan bahwa protein terglikosilasi penuh dapat dimuat di ER muNS-MS, sehingga meniru permukaan virus yang diselimuti.

Metodologi IC-Tagging juga menghadirkan sejumlah keunggulan kompetitif—seperti kesederhanaannya, efektivitas biaya, dan produksi protein yang tidak larut dan sulit diekspresikan dengan mudah—untuk produksi protein yang diimobilisasi dalam bentuk partikulat dalam kaitannya dengan teknik lain, seperti nanopartikel sintetis atau VLP. Selain itu, partikel-partikel ini tidak memiliki kendala struktural. Beberapa metode yang ada, misalnya, VLP, menyiratkan batasan arsitektural tentang berapa banyak protein asing yang diterima dan muatannya, dan bahkan mungkin mempengaruhi pelipatan peptida target yang tepat. MuNS-MS dan muNS-NS adalah agregat yang dipesan tanpa batasan struktural tertentu yang mengakui interaksi kuaterner antara monomer, protein dengan aktivitas enzimatik dan ukuran besar. Oleh karena itu, fitur khusus dari struktur ARV ini, seperti ukuran, organisasi, dan kemungkinan untuk menargetkannya dengan antigen asing, menjadikannya kandidat potensial untuk platform vaksin.